[發明專利]一種基于實時熒光定量PCR檢測土壤真菌數量的方法

在審

• 申請號: 202010063983.9
• 申請日: 2020-01-19
• 公開（公告）號: CN111057751A
• 公開（公告）日: 2020-04-24
• 發明（設計）人: 劉兵;曲朝磊;馬陽;徐杰;劉怡;楊藝紅;孫輝
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/06;C12R1/645
• 代理公司: 南京申云知識產權代理事務所(普通合伙) 32274
• 代理人: 邱興天

本發明公開了一種基于實時熒光定量PCR檢測土壤真菌數量的方法，屬于土壤真菌數量檢測領域。本發明公開的方法主要包括：稱取過篩的新鮮土壤，利用試劑盒提取土壤總DNA，統一稀釋到一定濃度；將生長適度的模板射紋革菌的菌絲利用CTAB法提取總DNA，制備成標準曲線系列模板DNA溶液；將標準曲線或待測土壤模板DNA溶液構建qPCR反應體系，包括根據真菌18S核糖體rRNA保守序列設計的通用qPCR引物；利用ABI7500實時熒光定量PCR儀進行qPCR反應；繪制出標準曲線；計算每克干土中真菌數量。本發明提供的檢測土壤真菌數量的方法，操作安全簡便，引物序列特異性好，靈敏度高，結果精準可靠，重現性好。

技術領域

本發明屬于土壤真菌數量檢測領域，更具體地說，涉及一種基于實時熒光定量PCR(qPCR)檢測土壤真菌數量的方法。

背景技術

真菌在農業和森林土壤生態系統中占有重要地位，每克土壤中真菌數目達到幾千萬個，根際土壤中真菌數目更是達到100倍之多。研究表明，真菌是連接土壤和植物之間的重要紐帶，與植物的生長息息相關。一方面真菌是有機質降解的主要微生物，其分泌的降解酶類是土壤養分轉化和能量流動的重要保障，另一方面真菌分泌植物促生或有害物質，增強植物抗病能力或誘導植物感病。同時，真菌也是土壤微生物的主要組分，全球土壤真菌生物量碳約為12Gt(噸)，是土壤細菌(7Gt)的兩倍，更是遠遠超過土壤動物(2Gt)和古細菌(0.5Gt)。由于區域內生物細胞的總豐度決定了土壤中有機質周轉率的上限，因此，土壤真菌的數量一定程度上反映土壤群落的基線功能潛力，是評價土壤微生物群落結構、土壤肥力高低和土壤結構改良的可靠指標。同時，由于真菌數量受到土地利用方式、植物群落結構、氣候條件和土壤理化性質等眾多因素影響。因此，提供一種簡單迅速、可批量操作和結果精準的真菌數量檢測方法具有重要的意義。

土壤真菌的數量一定程度上反映土壤群落的基線功能潛力，是評價土壤微生物群落結構、土壤肥力高低和土壤結構改良的可靠指標。但我國土壤真菌數量測定方法采用稀釋平板法、瓊脂膜法、麥角甾醇換算法和幾丁質換算法等方法，但存在著方法粗放煩瑣、與國際先進方法脫軌以及實驗設備落后等諸多問題。以稀釋平板法為例，由于全世界已知的真菌種類總數高達510萬種，遠遠超過最初估計的150萬種，但其中只有8萬種真菌可以人工培養，因此平板培養法局限性很大，不能獲得真菌數量的可靠信息；麥角甾醇和幾丁質換算法是基于真菌常見而特有的物質來估算土壤真菌的數量，方法雖簡單易行，但是特異性差，數據精準度較低；還有利用實時熒光定量PCR測定某一類特殊生理功能真菌，如發明專利201610473539.8，公開了基于實時熒光定量PCR檢測小麥根際土壤中叢枝菌根真菌數量的方法，該方法靈敏度雖高，但并不能表征土壤真菌整體數量。

發明內容

針對現有技術存在的上述問題，本發明所要解決的技術問題在于提供一種基于實時熒光定量PCR檢測土壤真菌數量的方法。

為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案如下：

一種基于實時熒光定量PCR檢測土壤真菌數量的方法，包括如下步驟：

1)提取土壤樣品總模板DNA并測定DNA濃度，稀釋制成待測土壤模板DNA溶液；

2)提取射紋革菌的菌絲中總DNA并測定DNA濃度，制備成標準曲線模板DNA溶液；

3)將標準曲線模板DNA溶液或待測土壤模板DNA溶液分別進行qPCR反應體系構建，所述qPCR反應體系包括針對常見土壤真菌18S核糖體rRNA保守序列設計的通用qPCR引物，所述通用qPCR引物包括：上游引物FF390序列為5′-CGATAACGAACGAGACCT-3′；下游引物FR1序列為5′-AICCATTCAATCGGTAIT-3′，其中I為次黃嘌呤堿基；

4)對步驟3)構建的qPCR反應體系進行qPCR反應；