[發明專利]一種基于實時熒光定量PCR檢測土壤真菌數量的方法

在審

• 申請號: 202010063983.9
• 申請日: 2020-01-19
• 公開（公告）號: CN111057751A
• 公開（公告）日: 2020-04-24
• 發明（設計）人: 劉兵;曲朝磊;馬陽;徐杰;劉怡;楊藝紅;孫輝
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/06;C12R1/645
• 代理公司: 南京申云知識產權代理事務所(普通合伙) 32274
• 代理人: 邱興天

1.一種基于實時熒光定量PCR檢測土壤真菌數量的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)提取土壤樣品總模板DNA并測定DNA濃度，稀釋制成待測土壤模板DNA溶液；

2)提取射紋革菌的菌絲中總DNA并測定DNA濃度，制備成標準曲線模板DNA溶液；

3)將標準曲線模板DNA溶液或待測土壤模板DNA溶液分別進行qPCR反應體系構建，所述qPCR反應體系包括針對常見土壤真菌18S核糖體rRNA保守序列設計的通用qPCR引物，所述通用qPCR引物包括：上游引物FF390序列為5′-CGATAACGAACGAGACCT-3′；下游引物FR1序列為5′-AICCATTCAATCGGTAIT-3′，其中I為次黃嘌呤堿基；

4)對步驟3)構建的qPCR反應體系進行qPCR反應；

5)以標準曲線模板DNA溶液中的目標特異性片段拷貝10的冪數和測定的循環數Ct值繪制出標準曲線：y＝ax+b，其中y為循環數Ct，x為目標特異性片段拷貝10的冪數，所述目標特異性片段是18S核糖體rRNA基因序列；

6)計算待測土壤模板DNA溶液的目標特異性片段總拷貝數N(copy)＝10^(Ct-b)/a，式中Ct為待測土壤模板DNA溶液測定的具體循環數，所述目標特異性片段是18S核糖體rRNA基因序列；

7)計算土壤樣品每克干土的真菌數量＝(c*V*N)/(c_r*V_r*m)，單位為copy/g；式中c為土壤樣品總模板DNA濃度，單位為ng/μL；c_r為待測土壤模板DNA溶液的濃度，單位為ng/μL；V為土壤樣品總模板DNA的體積，單位為μL，V_r為待測土壤模板DNA溶液的體積，單位為μL；m為用于提取總模板DNA的土壤樣品干重，單位為g。

2.根據權利要求1所述的基于實時熒光定量PCR檢測土壤真菌數量的方法，其特征在于，步驟1)具體為：稱取0.3g過2mm篩的新鮮土壤，利用OMEGA土壤DNA提取試劑盒提取土壤樣品總DNA并溶于滅菌雙蒸水中，測定DNA濃度，并將濃度統一稀釋到4-6ng/μL，作為待測土壤模板DNA溶液。

3.根據權利要求1所述的基于實時熒光定量PCR檢測土壤真菌數量的方法，其特征在于，步驟2)具體為：將22℃下180rpm震蕩馬鈴薯液體培養基培養生長2天的射紋革菌的菌絲倒扣在已滅菌的紗布上，擰干菌絲水分后于液氮中研磨成粉末；利用CTAB法提取0.2g所述粉末的總DNA，將所述總DNA溶于滅菌雙蒸水中，制備成標準曲線模板DNA母液，測定其DNA濃度，制備標準曲線模板DNA溶液。

4.根據權利要求3所述的基于實時熒光定量PCR檢測土壤真菌數量的方法，其特征在于，所述制備標準曲線模板DNA溶液的具體方法為：利用已知的射紋革菌基因組堿基數40.92Mb和質量4.48432×10^-5ng及其目標特異性片段拷貝數5個/基因組，計算出標準曲線模板DNA母液中的目標特異性片段拷貝濃度，單位為copy/μL；取適量母液加入滅菌雙蒸水調節目標特異性片段拷貝濃度至10⁸copy/5μL；取10μL 10⁸copy/5μL模板DNA溶液加入滅菌雙蒸水依次稀釋為10⁷copy/5μL，10⁶copy/5μL，10⁵copy/5μL，10⁴copy/5μL，10³copy/5μL的標準曲線模板DNA溶液，所述目標特異性片段是18S核糖體rRNA基因序列。

5.根據權利要求1所述的基于實時熒光定量PCR檢測土壤真菌數量的方法，其特征在于，步驟3)中所述qPCR反應體系構建的方法具體為：在96孔熒光定量板上，依次加入標準曲線模板DNA溶液/待測土壤模板DNA溶液5μL，10μM上游引物FF390溶液0.5μL，10μM下游引物FR1溶液0.4μL，2×Luna SYBR qPCR混合液10μL，再用滅菌雙蒸水將反應體系調節至20μL；用透明封膜密封96孔熒光定量板，采用微孔板離心機離心混勻。

6.根據權利要求1所述的基于實時熒光定量PCR檢測土壤真菌數量的方法，其特征在于，步驟4)具體為：利用ABI7500實時熒光定量PCR儀對步驟3)構建的qPCR反應體系進行qPCR反應，反應步驟為：95℃預變性3min；95℃變性15s，60℃退火+延伸1min，45個循環。