[發明專利]血清載脂蛋白A-II的分離純化方法

有效

• 申請號: 202010063680.7
• 申請日: 2020-01-20
• 公開（公告）號: CN111153985B
• 公開（公告）日: 2023-06-13
• 發明（設計）人: 夏杰;王劍;王民燕;普筱薇;葉浩威
• 申請（專利權）人: 寧波賽珀生物技術有限公司
• 主分類號: C07K14/775
• 分類號: C07K14/775;C07K1/20
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 王學芝

本發明公開了一種從血清中分離純化載脂蛋白A?II的方法，包括利用疏水層析填料對血清中的載脂蛋白A?II成分進行初步提純，用不含鹽的緩沖液洗雜，用含有有機醇的緩沖液洗脫并收集含A?II載脂蛋白的洗脫液，以及利用陰離子交換層析填料對收集的含A?II載脂蛋白的洗脫液進行精細提純，用含有去污劑和有機醇的緩沖液對載脂蛋白A?II進行柱上脫脂等步驟。本方法僅通過2步層析即得到純度≥95％的載脂蛋白A?II，回收率≥50％。

技術領域

本發明屬于生物化學領域，具體涉及一種載脂蛋白AII的分離純化方法。

背景技術

ApoAⅡ是HDL中含量第二多的載脂蛋白，早在1985年ApoAⅡ蛋白質的氨基酸序列、cDNA序列及基因序列均已闡明。ApoAⅡ在人血清中以二聚體的形式存在，其單體分子量為8700Da。人ApoAⅡ蛋白C端氨基酸殘基為谷氨酸，N端為吡咯烷酮酸，缺乏組氨酸，精氨酸及色氨酸。ApoAⅡ有多態性存在，最主要的多態型等電點為4.9，而含量較少的多態型的等電點為5.17、4.68、4.42和4.20。

ApoAⅡ的生理功能是：

1、維持HDL結構。ApoAⅡ肽段12-31和肽段50-77具有與磷脂的結合能力，經二級結構分析認為，殘基17-30和51-62形成的雙性螺旋結構是人ApoAⅡ與脂質結合的分子基礎。

2、激活肝脂酶。用以水解CM和VLDL中的TG和PL。還有報道，ApoAⅡ可抑制LCAT活性。ApoAⅡ由肝臟和小腸合成。人血漿中的ApoAⅡ生物半壽期為4.4天。

目前已知提取血清載脂蛋白A-II方法比較少，主要為超速離心法后用Scanu(1971)法脫脂。此方法制備載脂蛋白A-II的缺陷包括：1)成本高，對設備要求高；2)制備規模小；3)有機試劑脫脂容易導致樣品失活等。

發明內容

本發明的目的是提供一種血清載脂蛋白A-II的純化方法，它具有步驟簡單，制備規模易放大，樣品不易失活的特點。

本發明所采用的技術方案是：

血清載脂蛋白A-II的分離純化方法，包括有以下步驟：

1)利用疏水層析填料對血清中的載脂蛋白A-II成分進行初步提純，用不含鹽的緩沖液洗雜，用含有有機醇的緩沖液洗脫并收集含A-II載脂蛋白的洗脫液；

2)利用陰離子交換層析填料對步驟1)中收集的含A-II載脂蛋白的洗脫液進行精細提純，用含有去污劑和有機醇的緩沖液對載脂蛋白A-II進行柱上脫脂。

所述步驟1)中，疏水層析填料為Phenyl?Sepharose?High?Performance。

所述步驟1)中，疏水層析初步提純的過程包括平衡、上樣、洗雜、洗脫。

所述步驟1)中，不含鹽的緩沖液為pH?7.4的20mM?Tris-HCl緩沖液。

所述步驟1)中，含有有機醇的緩沖液為30—50％的pH?7.4的20mM?Tris-HCl緩沖液。

所述步驟2)中，陰離子交換層析填料為Q?Sephrose?HP。

所述步驟2)中，利用陰離子交換層析填料對步驟1)中收集的含A-II載脂蛋白的洗脫液進行精細提純過程包括平衡、上樣、脫脂、再平衡、洗脫。

所述步驟2)中，含有去污劑和有機醇的緩沖液為含有0.5％的去污劑，30—50％的有機醇的pH?7.4的20mM?Tris-HCl緩沖液。

所述去污劑為曲拉通X-100和聚多卡醇(Thesit)。

所述有機醇為乙二醇。