[發明專利]一種檢測凋落物乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的方法

有效

• 申請號: 202010063061.8
• 申請日: 2020-01-19
• 公開（公告）號: CN111707645B
• 公開（公告）日: 2023-05-16
• 發明（設計）人: 劉兵;曲朝磊;徐杰;馬陽;耿莉;楊藝紅;孫輝
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12Q1/34
• 分類號: C12Q1/34
• 代理公司: 南京申云知識產權代理事務所(普通合伙) 32274
• 代理人: 邱興天

本發明公開了一種檢測凋落物乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的方法，屬于酶活檢測技術領域。本發明提供的方法為：將凋落物樣品破碎后裝到離心過濾管中，添加培養緩沖液低溫培養后高速離心并混合濾液定容至一定體積，制備滅活酶液；將酶活性液和滅活酶液依次分別添加酶活性孔和陰性對照孔，再添加4?MUB?β?D?乙酰氨基葡萄糖苷工作液，在遮光條件下震蕩培養；培養后，向所有酶標孔添加Tris終止液；利用多功能酶標儀進行MUB熒光檢測；計算乙酰氨基葡萄糖苷酶比酶活。本發明采用離心過濾管，降低了酶液中的干擾物質；優化了反應體系，靈敏度高，酶液耗量少，反應終止后，測試液pH對上機數據沒有影響，真實有效反映凋落物中酶活性。

技術領域

本發明屬于酶活檢測技術領域，更具體地說，涉及一種檢測凋落物乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的方法。

背景技術

凋落物分解是森林土壤物質轉化的基礎，是植物和微生物養分的主要來源，在維持森林生態系統碳及養分循環中起重要作用。微生物是森林凋落物分解的主要貢獻者，在凋落物降解的過程中，凋落物上定殖的微生物會分泌各種胞外酶，改變凋落物的組成結構，從而促進凋落物的降解。作為參與凋落物分解最為重要的生物活性物質，酶活性涉及各種生物化學過程，與凋落物的分解直接相關，在很大程度上反映了土壤C、N、P等養分循環狀況，且因凋落物類型及環境條件的不同而異。研究凋落物中各種酶類活性在凋落物分解過程的活性動態，對了解森林凋落物分的微觀生態過程具有重要意義。

乙酰氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52)兼具幾丁質內切酶和外切酶的特性，能夠將土壤及凋落物中的通過β-1，4-糖苷鍵連接而成的幾丁質多糖水解成幾丁二糖、幾丁三糖等低聚糖。由于幾丁質是自然界中存量巨大的天然多聚物和含氮有機化合物，所以乙酰氨基葡萄糖苷酶在自然界的碳氮循環中起著關鍵作用，是今后生態研究的熱點。因此測定乙酰氨基葡萄糖苷酶活性有助于深入了解土壤碳氮轉化循環過程以及微生物氮素營養的獲取途徑，而提供一種操作便捷、靈敏度高和穩定性好的凋落物乙酰氨基葡萄糖苷酶活性檢測方法是解決問題的關鍵。

我國凋落物中乙酰氨基葡萄糖苷酶活性測定方法目前還無統一方法及標準，但可以借鑒有關土壤乙酰氨基葡萄糖苷酶活性測定方法。以采用紫外吸收波長定量的高效液相色譜分離法為例，雖然可同時測定包括乙酰氨基葡萄糖苷酶的多個酶活，但是存在粗酶液中膠體對對底物的吸附以及并不能有效反映凋落物自然pH條件下的酶活性等缺點；硝基苯基-β-氨基葡萄糖苷為底物進行酶解的色原底物法為例，也存在數據結果受測試液pH干擾乙酰氨基葡萄糖苷酶活性以及酶液消耗過多等問題。并且由于森林中原有凋落物構成復雜：可能有的表層凋落物沒有或者很少有降解微生物定殖，微生物分泌胞外乙酰氨基葡萄糖苷酶少，也有可能有的凋落物已經處于降解末期。這種復雜情況不利于多種樣本之間進行比較研究酶活性及其變化差異，因此凋落物酶活性的檢測比土壤酶活測定在前期也需要更多人工干預，使之標準化，以利于凋落物降解過程的研究。目前土壤乙酰氨基葡萄糖苷酶測定方法并不適合直接作為凋落物乙酰氨基葡萄糖苷酶活性測定標準化的操作流程。

綜上，目前需要提供一種新的、標準化、快速便捷的凋落物乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的檢測方法。

發明內容

針對現有技術存在的上述問題，本發明所要解決的技術問題在于提供一種一種檢測凋落物乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的方法。

為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案如下：

一種檢測凋落物乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的方法，包括如下步驟：

1)將培養緩沖液加入剪碎過篩后的待測凋落物，于離心過濾管離心得到酶濾液，將酶濾液進一步稀釋制成酶活待測液；

2)將步驟1)中制得的一部分酶活待測液進行加熱，使酶滅活，成為滅活酶液；

3)配制梯度濃度的4-甲基傘形酮(MUB)熒光標準物質溶液，采用多功能酶標儀進行熒光檢測；