[發(fā)明專利]一種檢測凋落物乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010063061.8
• 申請日: 2020-01-19
• 公開（公告）號: CN111707645B
• 公開（公告）日: 2023-05-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉兵;曲朝磊;徐杰;馬陽;耿莉;楊藝紅;孫輝
• 申請（專利權(quán)）人: 南京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/34
• 分類號: C12Q1/34
• 代理公司: 南京申云知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32274
• 代理人: 邱興天

1.一種檢測凋落物乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)將培養(yǎng)緩沖液加入剪碎過篩后的待測凋落物，于離心過濾管離心得到酶濾液，將酶濾液進一步稀釋制成酶活待測液；具體為：將待測凋落物剪碎過2mm篩，每個樣品稱取3個0.15g分別加入3個離心過濾管中，分別加入600μL?pH4?.5的培養(yǎng)緩沖液，在4℃下孵育60min后，4℃下16000×g離心30min得到酶濾液后并混合，用培養(yǎng)緩沖液調(diào)節(jié)體積至4mL，制得酶活待測液；

2)將步驟1)中制得的一部分酶活待測液進行加熱滅活，作為滅活酶液；具體為：從步驟1)制備的酶活待測液吸取1mL，在避光條件下85℃加熱2h，冷卻至室溫，得到滅活酶液；

3)配制梯度濃度的MUB熒光標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，采用多功能酶標(biāo)儀進行熒光檢測；

4)酶標(biāo)板的酶標(biāo)孔中分別加入酶活待測液和滅活酶液，再分別加入含有4-MUB-β-D-乙酰氨基葡萄糖苷的熒光底物工作液進行反應(yīng)，隨后加入終止液終止反應(yīng)；具體為：在黑色酶標(biāo)板上，將33.3μL酶活待測液加入樣品孔；將33?.3μL滅活酶液加入陰性對照孔；將750μM熒光底物工作液，即750μM?4-MUB-β-D-乙酰氨基葡萄糖苷溶液，按每孔66.7μL加入到所述樣品孔和陰性對照孔中；在避光22℃的條件下160rpm震蕩孵育反應(yīng)15min后，迅速向所有樣品孔和陰性對照孔中加入100μL?pH10-11的1M?Tris終止液終止反應(yīng)；

5)采用多功能酶標(biāo)儀對步驟4)反應(yīng)結(jié)果進行熒光檢測；

6)以MUB熒光標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液的梯度濃度和測定的對應(yīng)吸光值A(chǔ)繪制出熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率b；

7)計算酶活待測液的稀釋因子；具體為：計算待測樣品的稀釋因子R＝(200μL*4mL)/(33?.3μL*V)，200μL為100μL的反應(yīng)液加100μL終止液體積，4mL為培養(yǎng)緩沖液調(diào)節(jié)混合酶濾液后的酶活待測液體積，33.3μL為100μL反應(yīng)液中加入的酶活待測液體積，V為混合酶濾液的體積；

8)計算待測樣品的比酶活：(A活-A陰)*R/(b*t*m)，比酶活單位為pmol/min/g，A活為樣品孔的吸光值，A陰為陰性對照孔的吸光值，R為步驟7)所得稀釋因子，b為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，t為震蕩孵育時間15min，m為3個離心過濾管凋落物的干重，單位為g。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測凋落物乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于，步驟1)中所述培養(yǎng)緩沖液，其制備方法為：將3?.025gTris、3?.9g馬來酸、3?.5g檸檬酸或3.825g一水檸檬酸、1?.56g硼酸，和1M?122mL氫氧化鈉，用去離子水定容至250mL制備得到通用緩沖液原液，再將所述通用緩沖液原液用鹽酸調(diào)至pH?4?.5，用去離子水定容至1000mL，滅菌后4℃貯存，作為培養(yǎng)緩沖液備用。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測凋落物乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于，步驟3)具體為：稱取17?.6mg?MUB溶入2mL羥乙基甲醚中，再添加8mL無菌去離子水混合均勻成MUB母液；取40μL所述MUB母液用無菌去離子水調(diào)節(jié)體積至40mL，配制成10μM?MUB原液，遮光4℃環(huán)境下保存7天內(nèi)備用；取MUB原液用無菌去離子水稀釋至1μM，2μM，3μM，4μM，5μM的MUB熒光標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液；在黑色酶標(biāo)板上，依次加入100μL濃度為0μM，1μM，2μM，3μM，4μM，5μM的MUB熒光標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，4次重復(fù)，再分別加入100μL?pH10-11的1M?Tris終止液后，采用多功能酶標(biāo)儀進行熒光檢測。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測凋落物乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的方法，其特征在于，步驟4)中所述750μM?4-MUB-β-D-乙酰氨基葡萄糖苷溶液，其制備方法為：稱取18?.95mg4-MUB-β-D-乙酰氨基葡萄糖苷用超聲波震蕩或加熱至65℃溶入2mL羥乙基甲醚中，添加8mL無菌去離子水混合均勻，制備成5mM濃度4-MUB-β-D-乙酰氨基葡萄糖苷母液；取所述4-MUB-β-D-乙酰氨基葡萄糖苷母液按照3∶17的比例添加無菌去離子水進一步稀釋成750μM?4-MUB-β-D-乙酰氨基葡萄糖苷工作液，-20℃冷凍保存6個月內(nèi)備用。