[發明專利]一種人源檸檬酸轉運蛋白抑制劑化合物的篩選方法

在審

• 申請號: 202010063051.4
• 申請日: 2020-01-19
• 公開（公告）號: CN111239353A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發明（設計）人: 彭志剛;徐晶晶;陶敏;王曉輝;劉麗;藍偉銘;周煜;馮曉雨;金天添;荊為乾;涂成軍;潘歆蓓;王洋洋;王震
• 申請（專利權）人: 輝源生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: G01N33/15
• 分類號: G01N33/15;G01N27/62;C12N15/85;C07K14/47
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

本發明涉及一種人源檸檬酸轉運蛋白抑制劑化合物的篩選方法。利用能夠穩定表達人源檸檬酸轉運蛋白的細胞系，通過碳?14同位素標記的檸檬酸同位素攝取檢測方法，或通過基于高通量串聯質譜的檢測方法，實現對人源檸檬酸轉運蛋白抑制劑化合物的篩選。與現有技術相比，本發明方法可用來對化合物庫進行高通量篩選，從而得到人源檸檬酸轉運蛋白的陽性抑制劑化合物，為下一步的化合物結構改造及藥物發現奠定了基礎。本發明可以對大規模的化合物庫進行高通量篩選并獲得能夠抑制檸檬酸轉運蛋白作用、具有成為糖尿病等疾病治療藥物的潛力的化合物。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其是涉及一種人源檸檬酸轉運蛋白抑制劑化合物的篩選方法，以及以人源檸檬酸轉運蛋白為靶點的高通量篩選模型及其應用。

背景技術

檸檬酸轉運蛋白(NaCT)是由哺乳動物Indy基因編碼的質膜轉運體蛋白，屬于溶質轉運蛋白家族13(SLC13)的成員。NaCT主要在代謝活躍的組織中表達量較高，其功能為轉運三羧酸循環的中間體，并與其中的檸檬酸的親和力最高。研究表明檸檬酸轉運蛋白NaCT表達水平的降低會延長果蠅和線蟲壽命，同源蛋白在小鼠體內表達量下降所引起的代謝和生理方面的變化與熱量限制的效果十分一致。檸檬酸轉運蛋白基因敲除小鼠也表現出葡萄糖代謝和線粒體生物發生的方面的變化，并且保護其免受高熱量飲食的影響。這些數據支持了檸檬酸轉運蛋白作為代謝調節者的角色，這暗示檸檬酸轉運蛋白可以用于治療飲食和年齡相關性疾病，如II型糖尿病和肥胖癥，從而成為在糖尿病及肥胖的藥物研發中備受關注的新型靶點。

高通量藥物篩選是指以分子水平，細胞水平或微組織水平的實驗方法為基礎，以高密度微孔板(96孔，384孔，1536孔或3456孔)形式作為實驗工具載體，在短時間內對數百萬的樣品進行檢測，以半自動化或自動化操作系統執行試驗過程，通過快速靈敏的檢測儀器對實驗結果的數據采集，通過計算機程序軟件分析處理大量的實驗數據，并通過相應的數據庫運營維護來支持整體系運轉的技術體系。經典的高通量篩選系統一般包括以下部分：篩選模型，化合物樣品庫，自動化操作系統，高靈敏度的檢測系統和數據庫管理系統。

分子水平和細胞水平是最常用的篩選模型，通過分子水平和細胞水平的檢測可以觀察藥物與分子靶點的相互作用，從而能夠直接認識藥物的基本作用機制。其中，基于細胞水平的篩選模型主要使用細胞作為觀察對象，觀察被篩樣品對細胞的作用，通過細胞的不同反應來觀察化合物的作用。

發明內容

本發明提供一種以人源檸檬酸轉運蛋白為靶點的高通量篩選模型及其構建方法與應用。本發明利用表達人源檸檬酸轉運蛋白的穩轉細胞系，通過同位素攝取法或基于串聯質譜的檢測方法構建人源檸檬酸轉運蛋白抑制劑的高通量藥物篩選模型。本發明的篩選模型以人源檸檬酸轉運蛋白為靶點，可用于對現有化合物樣品庫進行篩選，找到具有新穎結構的針對檸檬酸轉運蛋白的抑制劑，從而為未來新型的糖尿病及肥胖病藥物的發現奠定基礎。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

本發明首先提供一種人源檸檬酸轉運蛋白抑制劑化合物的篩選方法，其特征在于，利用能夠穩定表達人源檸檬酸轉運蛋白(NaCT)的細胞系，通過碳-14同位素標記的檸檬酸同位素攝取檢測方法，或通過基于高通量串聯質譜的檢測方法，實現對人源檸檬酸轉運蛋白抑制劑化合物的篩選。

在本發明的一個實施方式中，所述能夠穩定表達人源檸檬酸轉運蛋白(NaCT)的細胞系所屬母細胞系選自HEK293、HEK293T、HEK293FT或CHO-K1。

在本發明的一個實施方式中，所述能夠穩定表達人源檸檬酸轉運蛋白(NaCT)的細胞系采用以下方法獲得：

A、基因合成人源檸檬酸轉運蛋白基因DNA序列，參考序列為NM_177550.3(humanSLC13A5 cDNA)的蛋白編碼序列(CDS)，在其CDS起始密碼子前加上KOZAK序列，再在序列兩端加上限制性酶切位點；

B、通過PCR擴增上述DNA序列，并回收PCR產物；