[發明專利]一種人源檸檬酸轉運蛋白抑制劑化合物的篩選方法

在審

• 申請號: 202010063051.4
• 申請日: 2020-01-19
• 公開（公告）號: CN111239353A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發明（設計）人: 彭志剛;徐晶晶;陶敏;王曉輝;劉麗;藍偉銘;周煜;馮曉雨;金天添;荊為乾;涂成軍;潘歆蓓;王洋洋;王震
• 申請（專利權）人: 輝源生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: G01N33/15
• 分類號: G01N33/15;G01N27/62;C12N15/85;C07K14/47
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

1.一種人源檸檬酸轉運蛋白抑制劑化合物的篩選方法，其特征在于，利用能夠穩定表達人源檸檬酸轉運蛋白的細胞系，通過碳-14同位素標記的檸檬酸同位素攝取檢測方法，或通過基于高通量串聯質譜的檢測方法，實現對人源檸檬酸轉運蛋白抑制劑化合物的篩選。

2.根據權利要求1所述人源檸檬酸轉運蛋白抑制劑化合物的篩選方法，其特征在于，所述能夠穩定表達人源檸檬酸轉運蛋白的細胞系所屬母細胞系選自HEK293、HEK293T、HEK293FT或CHO-K1。

3.根據權利要求1所述人源檸檬酸轉運蛋白抑制劑化合物的篩選方法，其特征在于，所述能夠穩定表達人源檸檬酸轉運蛋白的細胞系采用以下方法獲得：

A、基因合成人源檸檬酸轉運蛋白基因DNA序列，參考序列為NM_177550.3(humanSLC13A5 cDNA)的蛋白編碼序列，在其CDS起始密碼子前加上KOZAK序列，再在序列兩端加上限制性酶切位點；

B、通過PCR擴增上述DNA序列，并回收PCR產物；

C、對上述PCR產物進行酶切，并定向連接至含有抗性標記的真核表達質粒載體上；

D、用上述載體轉化大腸桿菌，并用選擇性培養基篩選出陽性單克隆，擴增陽性單克隆并提取質粒；

E、用上述真核表達質粒載體轉染母細胞，轉染培養24小時后用含有相應真核抗生素的培養基培養并篩選陽性單克隆，從而獲得能夠穩定表達人源檸檬酸轉運蛋白的細胞系。

4.根據權利要求1所述人源檸檬酸轉運蛋白抑制劑化合物的篩選方法，其特征在于，碳-14同位素標記的檸檬酸同位素攝取檢測方法，包括以下步驟：

A、傳代培養細胞；

B、用細胞培養液配制單細胞懸液，調整細胞密度為5×10⁵個/毫升至1×10⁶個/毫升；

C、轉移上述密度的細胞懸液到細胞實驗板中，每孔加入20微升，使得每孔有10000-20000個細胞；

D、將上述細胞實驗板放入二氧化碳細胞培養箱，37攝氏度培養16-24小時，使各孔中的細胞匯合率達到90％-100％；

E、棄掉實驗板里的細胞培養液，加入20微升含有所需檢測濃度的待測化合物的實驗緩沖液，在37攝氏度培養箱中孵育15-30分鐘；

F、每孔加入20微升含有20微摩爾/升碳-14同位素標記的檸檬酸的實驗緩沖液，在37攝氏度培養箱中孵育30-60分鐘；

G、使用讀板儀對上述實驗板各孔讀數；

H、實驗結果以均數±標準差表示，樣本均數的兩兩比較，采用t檢驗，P0.05表示有統計學意義上的顯著差異，采用軟件GraphPad Prism5計算IC50及作圖，IC50采用四因素回歸方式計算，公式如下：Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))。

5.根據權利要求1所述人源檸檬酸轉運蛋白抑制劑化合物的篩選方法，其特征在于，基于高通量串聯質譜的檢測方法，包括以下步驟：

A、傳代培養細胞；

B、用細胞培養液配制單細胞懸液，調整細胞密度，按照10000-20000個細胞/孔鋪入細胞實驗板中；

C、將上述細胞實驗板放入二氧化碳細胞培養箱，37攝氏度培養16-24小時；

D、棄掉細胞實驗板里的細胞培養液，加入10微升含有所需檢測濃度的待測化合物的實驗緩沖液，在37攝氏度培養箱中孵育10-20分鐘；

E、每孔加入10微升含有10微摩爾/升帶有氘原子標記的檸檬酸和10毫摩爾/升氯化鋰的實驗緩沖液，在37攝氏度培養箱中孵育180-300分鐘；

F、棄掉細胞實驗板里的實驗緩沖液，用PBS洗滌4-5次后，反復融凍5-10次，直至細胞全部脫落；

G、向細胞實驗板各孔加入150微升90％乙腈，震蕩20分鐘后離心；將樣品稀釋后，在高通量串聯質譜儀上檢測；

H、實驗結果以均數±標準差表示，樣本均數的兩兩比較，采用t檢驗，P0.05表示有統計學意義上的顯著差異，采用軟件GraphPad Prism計算IC50及作圖，IC50采用四因素回歸方式計算，公式如下：Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))。