[發(fā)明專利]一種基于臨床應(yīng)用的表皮黑素細(xì)胞分離培養(yǎng)及凍存方法和黑素細(xì)胞的凍存液

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010062560.5
• 申請日: 2020-01-20
• 公開（公告）號: CN111139217A
• 公開（公告）日: 2020-05-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曾金;麻彩麗;孫偉慶;黃偉
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州協(xié)合醫(yī)療用品有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A01N1/02
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務(wù)所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春

本發(fā)明提供了一種基于臨床應(yīng)用的表皮黑素細(xì)胞分離培養(yǎng)及凍存方法和黑素細(xì)胞的凍存液，包括黑素細(xì)胞從表皮的分離培養(yǎng)及凍存方法。本發(fā)明采用分散酶消化，所獲得的黑素細(xì)胞具有良好的增殖能力、優(yōu)良的黑色素表達(dá)能力。黑素細(xì)胞凍存液主要包括黑素細(xì)胞完全培養(yǎng)基、胎牛血清、二甲基亞砜，采用梯度凍存方法。該方法可用于培養(yǎng)增殖能力、遷移能力和黑素合成能力強的表皮黑素細(xì)胞，可以使患者的黑素細(xì)胞在體外更好的生長及分化，可用于臨床白癜風(fēng)或色素減退患者治療及其相關(guān)研究。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)，具體是一種基于臨床應(yīng)用的表皮黑素細(xì)胞分離培養(yǎng)及凍存方法黑素細(xì)胞的凍存液。

背景技術(shù)

傳統(tǒng)的白癜風(fēng)治療手段包括藥物治療、紫外線照射、外科手術(shù)治療，目前自體黑素細(xì)胞移植成為白癜風(fēng)治療的研究和發(fā)展方向之一，但需要短時間內(nèi)在體外大量擴增提高純度的黑素細(xì)胞。為此，很多適合黑素細(xì)胞生長的培養(yǎng)基和純化方法被報道，包括使用高濃度的胎牛血清培養(yǎng)基促進(jìn)細(xì)胞生長。

冷凍保存在細(xì)胞的短期和長期保存中起著重要作用，對組織和細(xì)胞建庫具有十分重要的意義。利用庫存組織的基于細(xì)胞的治療也越來越多地被用于再生醫(yī)學(xué)的其他領(lǐng)域，借助冷凍保存技術(shù)，種子細(xì)胞可通過細(xì)胞庫而及時提供，對臨床研究及應(yīng)用意義重大。冷凍保存降低了研發(fā)周期及成本，使得需要的種子細(xì)胞在嚴(yán)密監(jiān)控的條件下進(jìn)行生產(chǎn)和保存，且復(fù)蘇后不影響其性能。

通常在凍存后由于凍存液的配方及凍存方法不合適，黑素細(xì)胞的活性及增值能力大大降低，嚴(yán)重影響其色素修復(fù)效果。細(xì)胞凍存除了報道添加冷凍劑外，也有文獻(xiàn)增加細(xì)胞載體，一方面要考慮細(xì)胞載體厚度超過150um，有足夠的機械穩(wěn)定性使得在解凍后可控地將構(gòu)建體轉(zhuǎn)移進(jìn)入機體中。另一方面要求細(xì)胞在合成的細(xì)胞載體中不發(fā)生整合，或僅在有限的程度上可能發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，提供一種基于臨床應(yīng)用的表皮黑素細(xì)胞分離培養(yǎng)及凍存方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種黑素細(xì)胞的分離培養(yǎng)及凍存方法，其特征在于黑素細(xì)胞的分離培養(yǎng)包括以下步驟：

1).用PBS清洗表皮組織，醫(yī)用酒精浸泡，PBS中含有或不含有雙抗；

2).酒精浸泡好的表皮組織轉(zhuǎn)入裝有PBS的培養(yǎng)皿中，清洗數(shù)次后剪去皮下組織；

3).將處理好的皮膚組織用PBS清洗后，用消化酶消化，將皮膚組織修剪成一定大小的組織塊；

4).分離的表皮用PBS清洗后剪碎，加入胰蛋白酶消化；

5).在步驟4)消化后的組織中加入培養(yǎng)基，吹打獲得細(xì)胞懸液，過濾，PBS清洗，離心，黑素細(xì)胞培養(yǎng)基為黑素細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基加生長因子；

6).適量黑素細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，置于生化培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；

7).黑素細(xì)胞貼壁至50-80％融合時，用胰蛋白酶消化提純黑素細(xì)胞；

8).適量黑素細(xì)胞培養(yǎng)基重懸黑素細(xì)胞后離心，PBS清洗后再次離心。

9).黑素細(xì)胞培養(yǎng)基重懸黑素細(xì)胞后接種到培養(yǎng)瓶中；

黑素細(xì)胞的凍存液配方中包含二甲基亞砜(DMSO)，包含或不包含黑素細(xì)胞培養(yǎng)基，包含或不包含胎牛血清；

黑素細(xì)胞的凍存包括以下步驟：

10).待黑素細(xì)胞貼壁生長至80％-90％，PBS清洗后胰蛋白酶消化；

11).將收集的黑素細(xì)胞進(jìn)行離心，PBS重懸清洗后再次離心收集黑素細(xì)胞；

12).將收集的黑素細(xì)胞用配制好的凍存液重懸后轉(zhuǎn)移到凍存管中；

13).按照梯度凍存方法凍存黑素細(xì)胞。