[發(fā)明專利]一種基于臨床應用的表皮黑素細胞分離培養(yǎng)及凍存方法和黑素細胞的凍存液

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010062560.5
• 申請日: 2020-01-20
• 公開（公告）號: CN111139217A
• 公開（公告）日: 2020-05-12
• 發(fā)明（設計）人: 曾金;麻彩麗;孫偉慶;黃偉
• 申請（專利權）人: 杭州協合醫(yī)療用品有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A01N1/02
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春

1.一種黑素細胞的分離培養(yǎng)及凍存方法，其特征在于黑素細胞的分離培養(yǎng)包括以下步驟：

1).用PBS清洗表皮組織，醫(yī)用酒精浸泡，PBS中含有或不含有雙抗；

2).酒精浸泡好的表皮組織轉入裝有PBS的培養(yǎng)皿中，清洗數次后剪去皮下組織；

3).將處理好的皮膚組織用PBS清洗后，用消化酶消化，將皮膚組織修剪成一定大小的組織塊；

4).分離的表皮用PBS清洗后剪碎，加入胰蛋白酶消化；

5).在步驟4)消化后的組織中加入培養(yǎng)基，吹打獲得細胞懸液，過濾，PBS清洗，離心，黑素細胞培養(yǎng)基為黑素細胞基礎培養(yǎng)基加生長因子；

6).適量黑素細胞培養(yǎng)基重懸細胞后，置于生化培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；

7).黑素細胞貼壁至50-80％融合時，用胰蛋白酶消化提純黑素細胞；

8).適量黑素細胞培養(yǎng)基重懸黑素細胞后離心，PBS清洗后再次離心；

9).黑素細胞培養(yǎng)基重懸黑素細胞后接種到培養(yǎng)瓶中；

黑素細胞的凍存液配方中包含二甲基亞砜(DMSO)，包含或不包含黑素細胞培養(yǎng)基，包含或不包含胎牛血清；

黑素細胞的凍存包括以下步驟：

10).待黑素細胞貼壁生長至80％-90％，PBS清洗后胰蛋白酶消化；

11).將收集的黑素細胞進行離心，PBS重懸清洗后再次離心收集黑素細胞；

12).將收集的黑素細胞用配制好的凍存液重懸后轉移到凍存管中；

13).按照梯度凍存方法凍存黑素細胞。

2.如權利要求1所述的一種黑素細胞的分離培養(yǎng)及凍存方法，其特征在于步驟1)中，雙抗含量優(yōu)選0％-5％，酒精浸泡時間優(yōu)選10-200s；步驟3)中，將皮膚組織修剪成寬為0.5-10mm的組織塊，消化酶優(yōu)選中性蛋白酶，消化條件優(yōu)選4℃，消化時間優(yōu)選8-18h；步驟4)中，消化條件優(yōu)選37℃，消化時間優(yōu)選40-60min；步驟5)中，優(yōu)選100-200目不銹鋼網篩進行過濾，離心條件優(yōu)選1000-2000rmp，離心時間優(yōu)選3-10min；步驟6)中，培養(yǎng)條件為37℃、5％CO₂、飽和濕度，每24-48h換液一次；步驟7)中，采用梯度消化法提純黑素細胞，消化條件優(yōu)選10-30℃，消化時間優(yōu)選2-3min；步驟8)中，離心條件優(yōu)選1000-2000rmp，離心時間優(yōu)選3-10min；步驟9)中，細胞接種密度優(yōu)選1×10³-1×10⁵個/cm²；步驟10)中，消化條件優(yōu)選10-30℃，消化時間優(yōu)選2-3min；步驟10)中，離心條件優(yōu)選1000-2000rmp，離心時間優(yōu)選3-10min。

3.如權利要求1所述的一種黑素細胞的分離培養(yǎng)及凍存方法，其特征在于黑素細胞培養(yǎng)基﹕DMSO﹕胎牛血清的比例優(yōu)選0～92﹕7～10﹕0～93，最優(yōu)選比例：0﹕8﹕92。

4.如權利要求1所述的一種黑素細胞的分離培養(yǎng)及凍存方法，其特征在于步驟13)中的梯度凍存方法優(yōu)選4℃→-20℃→-80℃→液氮的方式，其中細胞在不同溫度下的優(yōu)選放置時間分別為20-40min、40-70min、10-20h、長期，梯度凍存的方式可使用程序降溫的細胞凍存盒，也可以利用冰箱人工操作。

5.黑素細胞的凍存液，其特征在于包含二甲基亞砜(DMSO)，包含或不包含黑素細胞培養(yǎng)基，包含或不包含胎牛血清。

6.如權利要求5所述的黑素細胞的凍存液，其特征在于黑素細胞培養(yǎng)基﹕DMSO﹕胎牛血清的比例優(yōu)選0～92﹕7～10﹕0～93。

7.如權利要求6所述的黑素細胞的凍存液，其特征在于黑素細胞培養(yǎng)基﹕DMSO﹕胎牛血清的比例最優(yōu)選比例是0﹕8﹕92。