[發明專利]一種人多能干細胞轉化為擴展多能干細胞的專用培養基及其應用

有效

• 申請號: 202010062150.0
• 申請日: 2020-01-19
• 公開（公告）號: CN111269878B
• 公開（公告）日: 2022-02-11
• 發明（設計）人: 蔣衛;耿婷;鄭冉
• 申請（專利權）人: 深圳市北科生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 唐萬榮

本發明公開一種人多能干細胞轉化為擴展多能干細胞的專用培養基及其應用。該培養基以1:1混合的knockout DMEM/F12和Neurobasal為基礎培養基，還包括以下組分：B27，N2，血清替代物，谷氨酸鹽,非必需氨基酸,雙抗,β?巰基乙醇，LCDM,WNT通路抑制劑和ROCK抑制劑。采用該培養基結合基質膠體系對人多能干細胞進行培養，可將其成功轉化成人擴展多能干細胞。該培養基化學成分明確，可以逆轉人多能干細胞命運，將人多能干細胞轉化為具有雙向嵌合能力的擴展多能干細胞，操作簡單，具有良好的應用前景。

技術領域

本發明屬于干細胞和再生醫學領域，具體涉及一種人多能干細胞轉化為擴展多能干細胞的專用培養基及其應用。

技術背景

在哺乳動物早期胚胎發育過程中，存在兩種不同類型的細胞，分別為全能(totipotent)細胞和多能(pluripotent)細胞。全能細胞具有最優越的發育潛能，能產生包括胚胎內和胚胎外組織在內的整個胚胎結構，而多能細胞只能發育為胚胎內組織。目前，桑葚胚之前的卵裂球被認為是全能的，在胚胎的第一個譜系特化過程中逐漸失去全能性并轉變為多能性。多能性的胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)或者誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)已經被建立并大量研究，而全能性細胞，尤其是人類全能性樣細胞，能否在體外穩定維持是一個長期以來試圖解決的問題。

在2017年，Yang等報道成功地在化合物小分子混合物培養基中維持了一種具有雙向嵌合能力細胞。具體而言，他們發現由人LIF、GSK3抑制劑CHIR 99021、DiM和MiH(稱為“LCDM”)組成的混合物培養基在有飼養層細胞支持下可以支持人傳統ESC轉化和維持立體克隆形態的擴展多能干細胞(extended pluripotent stem cell，EPSC)。這些細胞表現出廣泛的發育可塑性，在嵌合體實驗中不僅可以高效貢獻于胚胎組織，還可以貢獻于胚胎外組織。這一開拓性的工作，無論在發展潛力還是研究意義上，都產生了相比于其它多能干細胞不可替代的細胞類型。然而，該轉化條件用到了小鼠來源的飼養層培養體系。飼養層細胞的存在會帶來不確定因素，包括成分復雜性和不同批次之間的差異性，影響了進一步的分子機制探討和潛在的臨床應用。可見，建立不依賴飼養層細胞、成分明確、簡單快速的體系獲得擴展多能干細胞將極大拓展對于全能細胞的認識及將來的實際應用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種人多能干細胞轉化為擴展多能干細胞的專用培養基及其應用。該培養基化學成分明確，可以逆轉人多能干細胞命運，將人多能干細胞轉化為具有雙向嵌合能力的擴展多能干細胞，操作簡單，具有良好的應用前景。

為了解決上述技術問題，本發明提供以下技術方案：

提供一種將人多能干細胞轉化為擴展多能干細胞的培養基，所述培養基以1:1混合的knockout DMEM/F12和Neurobasal為基礎培養基，含有以下組分：1％B27，0.5％N2，5％血清替代物，1％谷氨酸鹽,1％非必需氨基酸,1％雙抗,0.1mMβ-巰基乙醇，10ng/mLrecombinant human LIF,1μM CHIR99021,2μM(S)-(+)-Dimethindene maleate,2μMMinocycline hydrochloride,0.5-5μM WNT通路抑制劑和1-10μM ROCK抑制劑。

按上述方案，所述WNT通路抑制劑為IWR-endo-1；所述ROCK抑制劑為Y-27632。

按上述方案，所述培養基還包括EZH2抑制劑。

按上述方案，所述EZH2抑制劑為GSK126，在培養基中的濃度為0.5-5μM。

按上述方案，所述培養基還包括糖酵解抑制劑，主要用于人多能干細胞向擴展多能干細胞轉變的晚期階段，所述晚期階段為擴展多能性維持過程階段。