[發明專利]一種人多能干細胞轉化為擴展多能干細胞的專用培養基及其應用

有效

• 申請號: 202010062150.0
• 申請日: 2020-01-19
• 公開（公告）號: CN111269878B
• 公開（公告）日: 2022-02-11
• 發明（設計）人: 蔣衛;耿婷;鄭冉
• 申請（專利權）人: 深圳市北科生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 唐萬榮

1.一種將人多能干細胞轉化為擴展多能干細胞的培養基，其特征在于，所述培養基以1:1混合的knockout DMEM/F12和Neurobasal為基礎培養基，還包括以下組分：1％B27，0.5％N2，5％血清替代物，1％谷氨酸鹽， 1％非必需氨基酸,1％雙抗,0.1mMβ-巰基乙醇，10ng/mL recombinant human LIF， 1μM CHIR99021， 2μM(S)-(+)-Dimethindenemaleate， 2μMMinocycline hydrochloride， 0.5-5μM WNT通路抑制劑和1-10μM ROCK抑制劑；其中所述培養基還包括EZH2抑制劑和/或糖酵解抑制劑。

2.根據權利要求1所述的培養基，其特征在于，所述WNT通路抑制劑為IWR-endo-1；所述ROCK抑制劑為Y-27632。

3.根據權利要求1所述的培養基，其特征在于，所述EZH2抑制劑為GSK126，在培養基中的濃度為0.5-5μM。

4.根據權利要求1所述的培養基，其特征在于，所述糖酵解抑制劑為2-DG或ATA，其中2-DG在培養基中的濃度為0.5-10mM，ATA在培養基中的濃度為10-100μM。

5.根據權利要求1所述的培養基，其特征在于，所述人多能干細胞為胚胎干細胞或誘導多能干細胞。

6.一種將人多能干細胞轉化成人擴展多能干細胞的培養方法，其特征在于，采用權利要求1-4任一項所述的培養基對人多能干細胞進行培養，將其轉化成人擴展多能干細胞。

7.根據權利要求6所述的培養方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

1)使用mTeSR1做基礎培養基，加入1％雙抗， 人多能干細胞于1：100稀釋比例的基質膠上培養；

2)步驟1)中人多能干細胞培養1-3d待人多能干細胞長成小克隆時換上權利要求1-4任一項所述的培養基，此為P1代，此時細胞長而排布整齊；

3)步驟2)所得P1代繼續培養1d后使用TrypLE傳代，1:3傳入1:(30-50)稀釋比的基質膠上；

4)當細胞覆蓋80-90％培養板底面積時及時傳代，將傳代比例從1：3逐漸降至1:10-20，傳入1:(30-50)稀釋比的基質膠上，至細胞克隆小而立體，無異質性，即轉化完全成功。

8.根據權利要求6所述的培養方法，其特征在于，還包括擴展多能性維持過程階段，具體為：擴展多能干細胞轉化完成后，選用權利要求1-4任一項所述的培養基繼續培養，維持擴展多能性狀態。