[發明專利]一種提高兩性霉素B產量的補料控制發酵方法

有效

• 申請號: 202010059607.2
• 申請日: 2020-01-19
• 公開（公告）號: CN111118090B
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: 柳志強;張博;張雨函;陳燏;陳開;鄭裕國
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12P19/62
• 分類號: C12P19/62;C12N1/20;C12R1/465
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

本發明涉及一種提高兩性霉素B產量的補料控制發酵方法，通過控制發酵體系pH、溫度、DO值、葡萄糖濃度和添加外源添加物達到提高提高兩性霉素B產量的目的。本發明分階段發酵調控策略能夠提供結節鏈霉菌一個最佳的菌體生長和產物合成的外部環境，有利于兩性霉素B的積累；同時補料調控則通過補料培養基和外源化合物的補料，避免了營養物質在發酵過程中的消耗，后期得不到必要的補充的問題。采用本發明發酵方法，兩性霉素B放罐單位可以達到16g/L以上，生產成本較目前的先進水平降低15％左右，所得兩性霉素B發酵液中，副產物兩性霉素A下降了30％以上，降低了后期分離純化的難度。

(一)技術領域

本發明涉及一種高產L-半胱氨酸的基因工程菌及構建方法，以及該基因工程菌在微生物發酵制備L-半胱氨酸中的應用。

(二)背景技術

兩性霉素B(Amphotericin B，AmB)是重要的抗真菌類抗生素，自1966年上市以來，一直是深部真菌感染的首選藥物。AmB純品的顏色為黃色或橘黃色，由于其分子結構中親水基團與疏水基團的不對稱分布和帶有酸堿性的特點，使得AmB在水相及大部分有機相中的溶解度極低。AmB抗真菌譜廣、活性強，對念珠菌、隱球菌、毛霉菌、曲霉菌、組織胞漿菌、球孢子菌等大多數深部真菌都有很強的抗真菌作用，還能有效抑制假絲酵母菌和用于治療利什曼病等，因此兩性霉素B及其衍生物的應用仍然非常廣泛。

目前兩性霉素B的工業生產仍主要采用的是微生物發酵法，微生物發酵生產抗生素的水平高低除了與菌種遺傳特性有關，還與發酵培養基成分和發酵條件及發酵過程控制有關。對于前者目前有誘變育種和分子改造等手段，對于后者主要通過優化得到最適發酵培養基配方、發酵培養條件，同時通過發酵過程控制及補料可實現抗生素的提產，尤其是與發酵調控結合下補料分批發酵能夠更有利于抗生素產量的提高。

補料可以解除底物抑制、產物反饋抑制和分解代謝物的阻遏；可以避免在分批發酵中因一次投料過多造成細胞大量生長所引起的影響，改善發酵流變學的性質；可用作控制細胞質量的手段，以提高發芽孢子的比例；可作為理論研究的手段，為自動控制和最優控制提供實驗基礎。AmB發酵屬于好氧過程，結節鏈霉菌在發酵過程中存在葡萄糖流加速率與溶氧控制相關聯的問題。如果葡萄糖流加過快，則會導致溶氧水平過低，使發酵處于厭氧狀態，目標產物產量降低；如果葡萄糖流加過慢，則會導致溶氧水平過高，菌體處于饑餓狀態，自溶現象增加，影響目標產物的產生。目前，兩性霉素B仍存在產量較低，產業化生產發展緩慢的問題限制了兩性霉素B的發展。因此，開拓出一條新的提高兩性霉素B的產量的方法，對實際應用具有很大意義。

(三)發明內容

本發明的目的是針對上述存在的缺陷而提供一種提高兩性霉素B產量的補料控制發酵方法。

本發明采用的技術方案是：

一種提高兩性霉素B產量的補料控制發酵方法，所述方法包括：將結節鏈霉菌接種至種子培養基，獲得種子液；種子液接種至發酵培養基，進行發酵培養，發酵總時間120±36小時(較佳的為132±12小時)，發酵過程中參數控制如下：

(1)控制發酵體系pH維持在6.0～7.5，直至發酵結束；

(2)在發酵培養第0～48h，維持溫度在30±3℃，當發酵至48h時，將溫度降至26±3℃，維持該溫度直至發酵結束；

(3)發酵前期使菌體在自然DO條件下生長，當發酵體系DO值下降至5～50％時，控制DO值維持在5％～50％至第108h，后恢復自然DO值直至發酵結束；

(4)控制發酵培養基中葡萄糖濃度，發酵過程中葡糖糖濃度下降到20～40g/L時，進行恒速補料，葡糖糖補料速率為0.1～5.0g/L·h；所用的發酵罐可為上海保興生物BIOTECH系列的5L發酵罐；每隔12h對葡萄糖濃度進行實時檢測。補料培養基為：100～500g/L葡萄糖，1～20g/L蛋白胨和0.01～5g/L硫酸銨，溶劑為水；