[發(fā)明專(zhuān)利]一種輔助突變引物的設(shè)計(jì)方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010058933.1
• 申請(qǐng)日: 2020-01-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111187805B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 閆亞平;張?chǎng)?/a>
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 陜西師范大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6811
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6811;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京睿智保誠(chéng)專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙) 11732
• 代理人: 周新楣

本發(fā)明公開(kāi)了一種輔助突變引物的設(shè)計(jì)方法及其應(yīng)用，該設(shè)計(jì)方法包括以下過(guò)程：利用LAMP技術(shù)，將待測(cè)堿基位于引物的3’端，然后人為突變待測(cè)堿基相鄰位置的堿基，獲得輔助突變引物；從而使DNA聚合酶在擴(kuò)增過(guò)程中能夠準(zhǔn)確識(shí)別位于引物3’端的待測(cè)堿基，顯著提高了Bst?DNAP?olymerase對(duì)引物3’端的識(shí)別能力，避免了探針的設(shè)計(jì)和使用，降低了檢測(cè)費(fèi)用，提高了檢測(cè)試劑保存的穩(wěn)定性；使用該方法設(shè)計(jì)CYP2C19*2和CYP2C19*3基因檢測(cè)的引物組，并將該引物組用于制備基因突變檢測(cè)試劑盒。該技術(shù)在實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)檢測(cè)的同時(shí)，也實(shí)現(xiàn)了即時(shí)檢測(cè)，并降低了檢測(cè)費(fèi)用和推廣難度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種輔助突變引物的設(shè)計(jì)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

CYP2C19基因定位于人類(lèi)10號(hào)染色體長(zhǎng)臂第24區(qū)，基因長(zhǎng)度約90.21Kb，含9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，可編碼由490個(gè)氨基酸組成的功能蛋白。CYP2C19基因具有高度的多態(tài)性，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有CYP2C19*2、*3、*4、*6、*9、*10、*17等多個(gè)突變等位基因，其中CYP2C19*2和CYP2C19*3是中國(guó)人群中最主要的等位基因型。CYP2C19*2等位基因突變是指CYP2C19基因第5外顯子681GA突變，該突變引起轉(zhuǎn)錄過(guò)程中一段堿基序列的丟失，導(dǎo)致CYP2C19酶活降低。CYP2C19*3等位基因突變是CYP2C19基因第4外顯子636GA突變，該突變導(dǎo)致原本的色氨酸密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，導(dǎo)致CYP2C19酶的合成提前終止。因此，CYP2C19*2和CYP2C19*3的突變均會(huì)導(dǎo)致CYP2C19酶活性的降低或喪失，導(dǎo)致其代謝底物的能力減弱，從而引起相關(guān)藥物代謝速率的個(gè)體化差異。

在人體中，CYP2C19參與的藥物代謝主要包括：氯吡格雷、苯妥英、伏立康唑和安定等。氯吡格雷是一種前體藥物，必須經(jīng)過(guò)肝細(xì)胞色素P450酶(CYP450)代謝為活性物質(zhì)，才能發(fā)揮其抗血小板聚集的作用。由于CYP2C19的基因多態(tài)性，患者對(duì)氯吡格雷的代謝能力也呈現(xiàn)個(gè)體化差異，弱代謝能力服用氯吡格雷則不能達(dá)到應(yīng)有的療效。因此，美國(guó)FDA建議在用藥前對(duì)患者進(jìn)行CYP2C19基因分型是非常必要的，對(duì)氯吡格雷弱代謝型患者建議采用其他抗凝血藥物。苯妥英一種臨床上常用的抗癲癇藥，研究表明苯妥英的代謝能力與CYP2C19*2和CYP2C19*3基因型密切相關(guān)。伏立康唑是一種廣普型抗真菌藥物，其代謝途徑同樣受CYP2C19調(diào)控，美國(guó)FDA批準(zhǔn)的藥物說(shuō)明書(shū)中特別指出，在使用伏立康唑前需要對(duì)CYP2C19基因進(jìn)行基因型檢測(cè)，以確保安全用藥。人體內(nèi)60％的安定是通過(guò)N-去甲基代謝途徑生成去甲安定，這一過(guò)程主要受CYP2C19和CYP3A調(diào)控。

綜上所述，CYP2C19基因型的確定在多種藥物選擇或劑量確定方面具有非常顯著的意義。然而目前CYP2C19基因型的檢測(cè)多采用PCR熒光探針?lè)āCR毛細(xì)管電泳分析法和焦磷酸測(cè)序法等，普遍具有價(jià)格昂貴、耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣、對(duì)操作人員技能要求較高等不足，無(wú)法在基層醫(yī)療單位進(jìn)行推廣。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-MediatedIsothermalAmplification,LAMP)由于其對(duì)檢測(cè)設(shè)備的要求較低，操作簡(jiǎn)便，以及高靈敏度，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病原微生物的檢測(cè)中。近年來(lái)也研究報(bào)道利用LAMP法檢測(cè)基因突變，但仍存在較為明顯的不足。如專(zhuān)利文獻(xiàn)CN?105861690?A利用肽核酸(PNA)制備的探針與DNA或RNA能夠形成穩(wěn)定的復(fù)合體，而單堿基突變能夠引起該復(fù)合體較大Tm值變化的原理，與LAMP技術(shù)結(jié)合。但目前肽核酸合成技術(shù)仍不成熟，合成的PNA純度一般僅能達(dá)到90％-95％，同時(shí)，肽核酸合成成本較高，合成50nmol的費(fèi)用高達(dá)5000-6000元左右，檢測(cè)費(fèi)用高。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種輔助突變引物的設(shè)計(jì)方法，并使用該方法對(duì)CYP2C19-2和CYP2C19-3基因檢測(cè)的引物組進(jìn)行設(shè)計(jì)，將所得的引物組用于制備基因突變檢測(cè)的試劑盒，解決現(xiàn)有的基因突變檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高、設(shè)備依賴(lài)度高等問(wèn)題。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：