[發明專利]一種輔助突變引物的設計方法及其應用

有效

• 申請號: 202010058933.1
• 申請日: 2020-01-19
• 公開（公告）號: CN111187805B
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 閆亞平;張鑫
• 申請（專利權）人: 陜西師范大學
• 主分類號: C12Q1/6811
• 分類號: C12Q1/6811;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務所(普通合伙) 11732
• 代理人: 周新楣

1.輔助突變引物的設計方法設計得到的引物組用于制備基因突變檢測試劑盒的應用；

所述的輔助突變引物的設計方法，包括以下過程：利用LAMP技術，將待測堿基位于引物的3’端，然后人為突變待測堿基相鄰位置的堿基，獲得輔助突變引物；

所述的輔助突變引物為F3、B3、FIP或BIP中的任意一條；突變的堿基為A、T、C和G四種堿基中除自身以外的其他三種堿基的任意一種：

F3-2和F3-3組合、F3-2和B3-3組合、F3-2和FIP-3組合、F3-2和BIP-3組合、B3-2和F3-3組合、B3-2和B3-3組合、B3-2和FIP-3組合、B3-2和BIP-3組合、FIP-2和F3-3組合、FIP-2和B3-3組合、FIP-2和FIP-3組合、FIP-2和BIP-3組合、BIP-2和F3-3組合、BIP-2和B3-3組合、BIP-2和FIP-3組合、BIP-2和BIP-3組合；

所述的F3-2包括A-CYP2C19*2-F3-W、A-CYP2C19*2-F3-M、A-CYP2C19*2-B3、A-CYP2C19*2-FIP、A-CYP2C19*2-BIP、A-CYP2C19*2-LF和A-CYP2C19*2-LB，其中各引物為：

A-CYP2C19*2-F3-W:5’-CACTATCATTGATTATTTCC?D?G-3’；

A-CYP2C19*2-F3-M:5’-CACTATCATTGATTATTTCC?D?A-3’；

A-CYP2C19*2-B3:5’-GTAAACACAAAACTAGTCAATGA-3’；

A-CYP2C19*2-FIP:5’-CATCGATTCTTGGTGTTCTTTTCCATAACAAATTA?CTTAAAAACCT-3’；

A-CYP2C19*2-BIP:5’-CCTCGGGACTTTATTGATTGCTCGCAAGCAGTCA?CATAACTAA-3’；

A-CYP2C19*2-LF:5’-TCTCCAAAATATCACTTTCCATA-3’；

A-CYP2C19*2-LB:5’-GGAGAAGGTAAAATGTTAACAAA-3’；

A-CYP2C19*2-F3-W為檢測野生型模板CYP2C19*2-G的引物，A-CYP2C19*2-F3-M為檢測突變型模板CYP2C19*2-A的引物，其中D為輔助突變堿基，為A、G、T中的任意一個堿基；

所述的F3-3包括A-CYP2C19*3-F3-W、A-CYP2C19*3-F3-M、A-CYP2C19*3-B3、A-CYP2C19*3-FIP、A-CYP2C19*3-BIP、A-CYP2C19*3-LF、A-CYP2C19*3-LB，其中各引物為：

A-CYP2C19*3-F3-W:5’-GATTGTAAGCACCCCCT?H?G-3’；

A-CYP2C19*3-F3-M:5’-GATTGTAAGCACCCCCT?HA-3’；

A-CYP2C19*3-B3:5’-CATTTCCTGTGCATAAAATAAAG-3’；

A-CYP2C19*3-FIP:5’-ATATAGAATTTTGGATTTCCCAGAACCAGGTAAG?GCCAAGTTTTTT-3’；

A-CYP2C19*3-BIP:5’-GACCAAGCCCTGAAGTACATTTTGCCATCTTTTC?CAGATATTCA-3’；

A-CYP2C19*3-LF:5’-AGACTGTAAGTGGTTTCTCAG-3’；

A-CYP2C19*3-LB:5’-CAGTCTTGCCTAGACAGCC-3’；

A-CYP2C19*3-F3-W為檢測野生型模板CYP2C19*3-G的引物，A-CYP2C19*3-F3-M為檢測突變型模板CYP2C19*3-A的引物，其中H為輔助突變堿基，為A、T、C中的任意一個堿基；

所述的B3-2包括B-CYP2C19*2-F3、B-CYP2C19*2-B3-W、B-CYP2C19*2-B3-M、B-CYP2C19*2-FIP、B-CYP2C19*2-BIP、B-CYP2C19*2-LF和B-CYP2C19*2-LB，其中各引物為：

B-CYP2C19*2-F3：5’-CTCAAATCTTGTATAATCAGAGA-3’；

B-CYP2C19*2-B3-W：5’-TAAGTAATTTGTTATGGGTTC?D?C-3’；

B-CYP2C19*2-B3-M：5’-TAAGTAATTTGTTATGGGTTC?D?T-3’；

B-CYP2C19*2-FIP:5’-GCCAAGCTCTGGTTGTAATTTAACTACACATGTAC?AATAAAAATTTC-3’；

B-CYP2C19*2-BIP:5’-GTATCTATACCTTTATTAAATGCTTTCAATGATAGT?GGGAAAATTATTG-3’；

B-CYP2C19*2-LF：5’-TATAAATATAAATAAAATATATTGTATAT-3’；

B-CYP2C19*2-LB：5’-TAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGAT-3’；

B-CYP2C19*2-B3-W為檢測野生型模板CYP2C19*2-G的引物，B-CYP2C19*2-B3-M為檢測突變型模板CYP2C19*2-A的引物，其中D為輔助突變堿基，為A、T、G中的任意一個堿基；

所述的B3-3包括B-CYP2C19*3-F3、B-CYP2C19*3-B3-W、B-CYP2C19*3-B3-M、B-CYP2C19*3-FIP、B-CYP2C19*3-BIP、B-CYP2C19*3-LF、B-CYP2C19*3-LB，其中各引物為：

B-CYP2C19*3-F3:5’-CTAATGTTTACTCATATTTTAAAATT-3’；

B-CYP2C19*3-B3-W:5’-AACTTGGCCTTACCTGGAV?C-3’；

B-CYP2C19*3-B3-M:5’-AACTTGGCCTTACCTGGAV?T-3’；

B-CYP2C19*3-FIP:5’-GAGCAGATCACATTGCAGGGACCAATCATTTAGC?TTCACCCT-3’；

B-CYP2C19*3-BIP:5’-CGTTTCGATTATAAAGATCAGCAAGGTGCTTACA?ATCCTGATGTT-3’；

B-CYP2C19*3-LF:5’-CAGCCCAGGATGAAAGTGG-3’；

B-CYP2C19*3-LB:5’-CTTAACTTGATGGAAAAATTGAAT-3’；

B-CYP2C19*3-B3-W為檢測野生型模板CYP2C19*3-G的引物，B-CYP2C19*3-B3-M為檢測突變型模板CYP2C19*3-A的引物，其中V為輔助突變堿基，為A、C、G中的任意一個堿基；

所述的FIP-2包括C-CYP2C19*2-F3、C-CYP2C19*2-B3、C-CYP2C19*2-FIP-W、C-CYP2C19*2-FIP-M、C-CYP2C19*2-BIP、C-CYP2C19*2-LF和C-CYP2C19*2-LB，其中各引物為：

C-CYP2C19*2-F3:5’-GTTTTCTCTTAGATATGCAATAAT-3’；

C-CYP2C19*2-B3:5’-CAGTCACATAACTAAGCTTTTG-3’；

C-CYP2C19*2-FIP-W:5’-CTTTCTCCAAAATATCACTTTCCACACTATCAT?TGATTATTTCC?D?G-3’；

C-CYP2C19*2-FIP-M:5’-CTTTCTCCAAAATATCACTTTCCACACTATCAT?TGATTATTTCC?D?A-3’；

C-CYP2C19*2-BIP:5’-ACACCAAGAATCGATGGACATCACCTTCTCCATT?TTGATCAGG-3’；

C-CYP2C19*2-LF:5’-GCAAGGTTTTTAAGTAATTTGTTA-3’；

C-CYP2C19*2-LB:5’-CTCGGGACTTTATTGATTGCT-3’；

C-CYP2C19*2-FIP-W為檢測野生型模板CYP2C19*2-G的引物，C-CYP2C19*2-FIP-M為檢測突變型模板CYP2C19*2-A的引物，其中D為輔助突變堿基，為A、G、T中的任意一個堿基；

所述的FIP-3包括C-CYP2C19*3-F3、C-CYP2C19*3-B3、C-CYP2C19*3-FIP-W、C-CYP2C19*3-FIP-M、C-CYP2C19*3-BIP、C-CYP2C19*3-LF和C-CYP2C19*3-LB，其中各引物為：

C-CYP2C19*3-F3:5’-GATGGAAAAATTGAATGAAAACAT-3’；

C-CYP2C19*3-B3:5’-CCTGTGCATAAAATAAAGAACTT-3’；

C-CYP2C19*3-FIP-W:5’-TTCCCAGAAAAAAAGACTGTAAGTGATTGTAA?GCACCCCCT?H?G-3’；

C-CYP2C19*3-FIP-M:5’-TTCCCAGAAAAAAAGACTGTAAGTGATTGTAA?GCACCCCCT?HA-3’；

C-CYP2C19*3-BIP:5’-GACCAAGCCCTGAAGTACATTTCCATCTTTTCCA?GATATTCACC-3’；

C-CYP2C19*3-LF:5’-GGAAGCAAAAAACTTGGCCTT-3’；

C-CYP2C19*3-LB:5’-CTACAGTCTTGCCTAGACAG-3’；

C-CYP2C19*3-FIP-W為檢測野生型模板CYP2C19*3-G的引物，C-CYP2C19*3-FIP-M為檢測突變型模板CYP2C19*3-A的引物，其中H為輔助突變堿基，為A、T、C中的任意一個堿基；

所述的BIP-2包括D-CYP2C19*2-F3、D-CYP2C19*2-B3、D-CYP2C19*2-FIP、D-CYP2C19*2-BIP-W、D-CYP2C19*2-BIP-M、D-CYP2C19*2-LF和D-CYP2C19*2-LB，其中各引物為：

D-CYP2C19*2-F3:5’-GAGAATTACTACACATGTACAAT-3’；

D-CYP2C19*2-B3:5’-CTCCAAAATATCACTTTCCATAA-3’；

D-CYP2C19*2-FIP:5’-GGTATAGATACAATATGCCAAGCTTCCCCATCAAG?ATATACAATATA-3’；

D-CYP2C19*2-BIP-W:5’-TTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATAAGTAA?TTTGTTATGGGTTC?DC-3’；

D-CYP2C19*2-BIP-M:5’-TTTAATAAATTATTGTTTTCTCTTAGATAAGTAA?TTTGTTATGGGTTC?DT-3’；

D-CYP2C19*2-LF:5’-GGTTGTAATTTAAAACTATAAATATA-3’；

D-CYP2C19*2-LB:5’-GCAATAATTTTCCCACTATCATT-3’；

D-CYP2C19*2-BIP-W為檢測野生型模板CYP2C19*2-G的引物，D-CYP2C19*2-BIP-M為檢測突變型模板CYP2C19*2-A的引物，其中D為輔助突變堿基，為A、G、T中的任意一個堿基；

所述的BIP-3包括D-CYP2C19*3-F3、D-CYP2C19*3-B3、D-CYP2C19*3-FIP、D-CYP2C19*3-BIP-W、D-CYP2C19*3-BIP-M、D-CYP2C19*3-LF和D-CYP2C19*3-LB，其中各引物為：

D-CYP2C19*3-F3：5’-TTCACCCTGTGATCCCACTT-3’；

D-CYP2C19*3-B3：5’-GTAAGTGGTTTCTCAGGAAGC-3’；

D-CYP2C19*3-FIP:5’-GCTGATCTTTATAATCGAAACGTTTCCTGGGCTGT?GCTCCCT-3’；

D-CYP2C19*3-BIP-W:5’-CTTAACTTGATGGAAAAATTGAATGAACTTGG?CCTTACCTGGAV?C-3’；

D-CYP2C19*3-BIP-M:5’-CTTAACTTGATGGAAAAATTGAATGAACTTGG?CCTTACCTGGAV?T-3’；

D-CYP2C19*3-LF：5’-TGGAAAATAATGGAGCAGATCA-3’；

D-CYP2C19*3-LB：5’-AACATCAGGATTGTAAGCACC-3’；

D-CYP2C19*3-BIP-W為檢測野生型模板CYP2C19*3-G的引物，D-CYP2C19*3-BIP-M為檢測突變型模板CYP2C19*3-A的引物，其中V為輔助突變堿基，為A、C、G中的任意一個堿基；

所述的試劑盒為檢測CYP2C19*2和CYP2C19*3基因的試劑盒，所述的試劑盒包括如前所述的引物組、Bst?DNA?Polymerase、dNTP、緩沖液、指示劑和添加劑；

所述的緩沖液包括Tris-HCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄和Tween-20；

所述的指示劑為SYBR?Green?I溶液或Calcein溶液和MnCl₂溶液的混合液；

所述的添加劑包括海藻糖和BSA；

所述的引物組每一組中的F3的濃度與B3的濃度相同，為0.8～1.6μmol/L；LF和LB的濃度相同，為1.6～3.2μmol/L；FIP與BIP的濃度相同，為1.6～3.2μmol/L；

所述的Bst?DNAPolymerase0.3～0.4U/μl；所述的dNTP為1.0～3.5mmol/L；

所述的緩沖液中Tris-HCl為10～50mmol/L、KCl為10～100mmol/L、(NH₄)₂SO₄為5～20mmol/L、MgSO₄為6～10mmol/L、Tween-20質量占緩沖液質量為0.1％～0.5％；

所述的SYBR?Green?I濃度為1×～5×；所述的Calcein和MnCl₂的混合液中，Calcein溶液濃度為10～30μmol/L，MnCl₂溶液的為500μmol/L；

所述的添加劑中海藻糖為0.1～0.3mol/L，BSA為0.2～1mg/ml。