[發(fā)明專利]一種鴨卵巢顆粒細胞的分離培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010057220.3
• 申請日: 2020-01-19
• 公開（公告）號: CN111040989A
• 公開（公告）日: 2020-04-21
• 發(fā)明（設計）人: 張蕾;朱睿;章敬旗;王健;張海波
• 申請（專利權）人: 江蘇農牧科技職業(yè)學院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249
• 代理人: 孫峰

本發(fā)明涉及卵巢顆粒細胞的分離培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種鴨卵巢顆粒細胞的分離培養(yǎng)方法，所述鴨卵巢顆粒細胞的分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟：（1）將母鴨頸部放血處死，取出完整的卵巢；（2）剪取完整的排卵前卵泡，得到單顆排卵前卵泡；（3）將沖洗干凈的單顆排卵前卵泡剪開，刮除卵黃后沖洗5次；（4）分別采用透明質酸酶和胰蛋白酶對清洗后的顆粒細胞層進行消化；（5）對消化后的顆粒細胞層進行重懸，并將細胞懸液加入培養(yǎng)基中用移液器反復吹打以使細胞分散；（6）對重懸后的細胞懸液進行恒溫箱培養(yǎng)。采用本發(fā)明提供的分離培養(yǎng)方法得到的鴨卵巢顆粒細胞純度高，活力高，且鴨卵巢顆粒細胞的成活率高。

技術領域

本發(fā)明涉及卵巢顆粒細胞的分離培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種鴨卵巢顆粒細胞的分離培養(yǎng)方法。

背景技術

隨著畜牧業(yè)大規(guī)模集約化生產的快速發(fā)展，鴨的產蛋量是制約鴨產業(yè)化發(fā)展的極為重要的因素之一，亟待育種工作者解決。卵巢是雌性動物的主要繁殖器官，卵巢上卵泡的周期性變化是其最主要的生理活動。鴨的等級卵泡有嚴格的階級發(fā)育體系，依次經由原始卵泡、小白卵泡、大白卵泡、小黃卵泡、大黃卵泡以及排卵前卵泡發(fā)育成熟。在這個過程中，鴨可以通過調控等級卵泡的數(shù)量及其閉鎖來調節(jié)排卵的速度，進而影響其自身的產蛋性能。

卵泡顆粒細胞是卵泡發(fā)育和維持正常功能的重要條件，對維持卵巢繁殖功能發(fā)揮著極其重要的作用。有研究者發(fā)現(xiàn)，卵泡閉鎖退化的過程是由卵泡中顆粒細胞的凋亡觸發(fā)的，顆粒細胞的凋亡最終會導致卵泡的閉鎖。在卵泡顆粒細胞中可以分泌類固醇激素、促卵泡素和促黃體素等激素，還可以產生一些細胞因子（孕酮、干細胞生長因子和表皮生長因子等），調控著卵泡和卵母細胞的生長發(fā)育。因此，探尋一種鴨卵巢顆粒細胞體外分離培養(yǎng)的方法，對卵巢顆粒細胞增殖、凋亡機制進行深入的研究，對于闡明卵巢顆粒細胞對家禽的產蛋性能所發(fā)揮的調控機制有著重要的理論和實際意義。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術存在的問題，提供一種鴨卵巢顆粒細胞的分離培養(yǎng)方法，解決了目前尚未有完善及高效的鴨卵巢顆粒細胞分離培養(yǎng)方法的問題。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種鴨卵巢顆粒細胞的分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

（1）將母鴨頸部放血處死，取出完整的卵巢，并用1%雙抗DPBS溶液進行沖洗；并將沖洗干凈的卵巢置于加有 37℃的1%雙抗DPBS溶液的保溫容器中，4小時內轉移至細胞間；

（2）剪取完整的排卵前卵泡，單顆置于含有1%雙抗DPBS溶液的培養(yǎng)皿中，剝離卵泡外的細膜和血管，得到單顆排卵前卵泡，接著用1%雙抗PBS溶液沖洗；

（3）將沖洗干凈的單顆排卵前卵泡剪開，刮除卵黃后含有1%雙抗DPBS溶液的60 mm 新培養(yǎng)皿中依次沖洗5次；

（4）分別采用透明質酸酶和胰蛋白酶對清洗后的顆粒細胞層進行消化；

（5）對消化后的顆粒細胞層進行重懸，并將細胞懸液加入培養(yǎng)基中用移液器反復吹打以使細胞分散；

（6）吸取重懸后的細胞懸液用細胞篩過濾，收集過濾后的細胞懸液檢測顆粒細胞密度，而后調整其密度在1×10⁶個/孔，35 mm培養(yǎng)皿分裝，每皿吸取細胞懸液2mL，8%胎牛血清的培養(yǎng)基1mL，37℃、5% CO2恒溫箱培養(yǎng)；

（7）培養(yǎng)24h換半液，48h 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，待顆粒細胞生長匯合率達到50%，換全液加入10% 胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

優(yōu)選條件下，所述母鴨為280-330日齡的母鴨。

優(yōu)選條件下，在步驟（4）中，所述采用透明質酸酶對顆粒細胞層進行消化的方法為：將清洗后的顆粒細胞層置于5 mL 離心管中，加入1mL 1g/L的透明質酸酶，用眼科剪持續(xù)剪碎組織3min，并用移液器反復吹打使細胞分散，置于37℃水浴消化3min，而后加入1mL10% 胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。