[發(fā)明專利]一種鴨卵巢顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010057220.3
• 申請日: 2020-01-19
• 公開（公告）號: CN111040989A
• 公開（公告）日: 2020-04-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張蕾;朱睿;章敬旗;王健;張海波
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32249
• 代理人: 孫峰

1.一種鴨卵巢顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）將母鴨頸部放血處死，取出完整的卵巢，并用1%雙抗DPBS溶液進行沖洗；并將沖洗干凈的卵巢置于加有 37℃的1%雙抗DPBS溶液的保溫容器中，4小時內(nèi)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞間；

（2）剪取完整的排卵前卵泡，單顆置于含有1%雙抗DPBS溶液的培養(yǎng)皿中，剝離卵泡外的細(xì)膜和血管，得到單顆排卵前卵泡，接著用1%雙抗PBS溶液沖洗；

（3）將沖洗干凈的單顆排卵前卵泡剪開，刮除卵黃后含有1%雙抗DPBS溶液的60 mm 新培養(yǎng)皿中依次沖洗5次；

（4）分別采用透明質(zhì)酸酶和胰蛋白酶對清洗后的顆粒細(xì)胞層進行消化；

（5）對消化后的顆粒細(xì)胞層進行重懸，并將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)基中用移液器反復(fù)吹打以使細(xì)胞分散；

（6）吸取重懸后的細(xì)胞懸液用細(xì)胞篩過濾，收集過濾后的細(xì)胞懸液檢測顆粒細(xì)胞密度，而后調(diào)整其密度在1×10⁶個/孔，35 mm培養(yǎng)皿分裝，每皿吸取細(xì)胞懸液2mL，8%胎牛血清的培養(yǎng)基1mL，37℃、5% CO₂恒溫箱培養(yǎng)；

（7）培養(yǎng)24h換半液，48h 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待顆粒細(xì)胞生長匯合率達(dá)到50%，換全液加入10% 胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨卵巢顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述母鴨為280-330日齡的母鴨。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨卵巢顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，在步驟（4）中，所述采用透明質(zhì)酸酶對顆粒細(xì)胞層進行消化的方法為：將清洗后的顆粒細(xì)胞層置于5 mL離心管中，加入1mL 1g/L的透明質(zhì)酸酶，用眼科剪持續(xù)剪碎組織3min，并用移液器反復(fù)吹打使細(xì)胞分散，置于37℃水浴消化3min，而后加入1mL 10% 胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鴨卵巢顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，在步驟（4）中，所述消化還包括：所述采用胰蛋白酶對顆粒細(xì)胞層進行消化的方法為：1500 rmp離心5min，棄上清，加入1mL 0.25%胰蛋白酶，移液器反復(fù)吹打使細(xì)胞分散，置于37℃水浴消化3min，而后加入1mL 10% 胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨卵巢顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟（5）的具體步驟為：將消化后的顆粒細(xì)胞層加入2 mL 10%胎牛血清的培養(yǎng)基進行重懸，并將細(xì)胞懸液用移液器移至10 mL 離心管中，再次加入3 mL 8% 胎牛血清的培養(yǎng)基，用移液器反復(fù)吹打以使細(xì)胞分散。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨卵巢顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，在步驟（6）中，所述細(xì)胞篩為200目細(xì)胞篩。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨卵巢顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，在步驟（7）中，所述胎牛血清的濃度為10%。