[發明專利]一種鴨卵巢顆粒細胞的分離培養方法

在審

• 申請號: 202010057220.3
• 申請日: 2020-01-19
• 公開（公告）號: CN111040989A
• 公開（公告）日: 2020-04-21
• 發明（設計）人: 張蕾;朱睿;章敬旗;王健;張海波
• 申請（專利權）人: 江蘇農牧科技職業學院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙) 32249
• 代理人: 孫峰

1.一種鴨卵巢顆粒細胞的分離培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）將母鴨頸部放血處死，取出完整的卵巢，并用1%雙抗DPBS溶液進行沖洗；并將沖洗干凈的卵巢置于加有 37℃的1%雙抗DPBS溶液的保溫容器中，4小時內轉移至細胞間；

（2）剪取完整的排卵前卵泡，單顆置于含有1%雙抗DPBS溶液的培養皿中，剝離卵泡外的細膜和血管，得到單顆排卵前卵泡，接著用1%雙抗PBS溶液沖洗；

（3）將沖洗干凈的單顆排卵前卵泡剪開，刮除卵黃后含有1%雙抗DPBS溶液的60 mm 新培養皿中依次沖洗5次；

（4）分別采用透明質酸酶和胰蛋白酶對清洗后的顆粒細胞層進行消化；

（5）對消化后的顆粒細胞層進行重懸，并將細胞懸液加入培養基中用移液器反復吹打以使細胞分散；

（6）吸取重懸后的細胞懸液用細胞篩過濾，收集過濾后的細胞懸液檢測顆粒細胞密度，而后調整其密度在1×10⁶個/孔，35 mm培養皿分裝，每皿吸取細胞懸液2mL，8%胎牛血清的培養基1mL，37℃、5% CO₂恒溫箱培養；

（7）培養24h換半液，48h 倒置顯微鏡下觀察細胞形態，待顆粒細胞生長匯合率達到50%，換全液加入10% 胎牛血清的培養基繼續培養。

2.根據權利要求1所述的鴨卵巢顆粒細胞的分離培養方法，其特征在于，所述母鴨為280-330日齡的母鴨。

3.根據權利要求1所述的鴨卵巢顆粒細胞的分離培養方法，其特征在于，在步驟（4）中，所述采用透明質酸酶對顆粒細胞層進行消化的方法為：將清洗后的顆粒細胞層置于5 mL離心管中，加入1mL 1g/L的透明質酸酶，用眼科剪持續剪碎組織3min，并用移液器反復吹打使細胞分散，置于37℃水浴消化3min，而后加入1mL 10% 胎牛血清的培養基終止消化。

4.根據權利要求3所述的鴨卵巢顆粒細胞的分離培養方法，其特征在于，在步驟（4）中，所述消化還包括：所述采用胰蛋白酶對顆粒細胞層進行消化的方法為：1500 rmp離心5min，棄上清，加入1mL 0.25%胰蛋白酶，移液器反復吹打使細胞分散，置于37℃水浴消化3min，而后加入1mL 10% 胎牛血清的培養基終止消化。

5.根據權利要求1所述的鴨卵巢顆粒細胞的分離培養方法，其特征在于，所述步驟（5）的具體步驟為：將消化后的顆粒細胞層加入2 mL 10%胎牛血清的培養基進行重懸，并將細胞懸液用移液器移至10 mL 離心管中，再次加入3 mL 8% 胎牛血清的培養基，用移液器反復吹打以使細胞分散。

6.根據權利要求1所述的鴨卵巢顆粒細胞的分離培養方法，其特征在于，在步驟（6）中，所述細胞篩為200目細胞篩。

7.根據權利要求1所述的鴨卵巢顆粒細胞的分離培養方法，其特征在于，在步驟（7）中，所述胎牛血清的濃度為10%。