[發明專利]一種人卵巢癌干細胞富集及流式分選的方法

在審

• 申請號: 202010056543.0
• 申請日: 2020-01-18
• 公開（公告）號: CN111254116A
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 陳智毅;劉付春;余金穗;李悅;王奕;張輝;屠佳偉
• 申請（專利權）人: 廣州醫科大學附屬第三醫院（廣州重癥孕產婦救治中心;廣州柔濟醫院）
• 主分類號: C12N5/095
• 分類號: C12N5/095;C12N5/02;G01N15/14
• 代理公司: 廣州凱東知識產權代理有限公司 44259
• 代理人: 姚迎新

本發明公開了一種人卵巢癌干細胞富集及流式分選的方法，包括使用無血清懸浮細胞培養法或者順鉑細胞培養法富集人卵巢癌A2780細胞初步篩選出腫瘤干細胞，再根據卵巢癌干細胞的標志物ALDH1,使用流式細胞儀進一步分選。本發明結合了現有懸浮培養法及流式分選方法、藥物篩選富集法及流式分選方法的優點，通過無血清懸浮培養或者化療藥物篩選，使卵巢癌中的腫瘤干細胞富集，再通過流式細胞儀分選，從而保證卵巢癌腫瘤干細胞分選的效率。本發明卵巢癌干細胞得率可達54.8％，為下一步研究卵巢癌干細胞的提供條件。

技術領域

本發明涉及腫瘤干細胞分離技術，尤其涉及卵巢癌干細胞分離技術。

背景技術

腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)是腫瘤中具有高度的增殖、自我更新和分化潛能的一類細胞，同時具備干細胞和腫瘤細胞的特征，它們被認為是腫瘤演進、轉移復發的“種子”，大量的臨床和實驗觀察證實它們與腫瘤放化療耐受以及腫瘤患者預后較差密切相關。很多研究已證實多種實體腫瘤中含有CSCs。然而，越來越清楚的是，CSCs不一定是罕見和/或靜止的。腫瘤干細胞的發現和理論深入離不開對腫瘤標志物的研究。不同腫瘤組織所含的CSCs標志物不盡相同，目前體外實驗已證實卵巢癌中高表達ALDH1、CD133、CD44等分子的這一類細胞具有致瘤性和促進腫瘤轉移的能力。

CSCs在腫瘤組織和細胞中只占很少的比例，一般不到1％，因此CSCs的分離有難度。常見分離CSCs的常用技術有以下兩大類：第一，利用CSCs表面標志物進行分離(以CSCs標志物、生物酶類及特定染料等為基礎的流式細胞術；免疫磁珠技術)；第二，利用CSCs的生物學特性進行分離(無血清懸浮成球培養；根據CSCs的耐藥特性,采用Hoechst33342染色分選側群(side population,SP)細胞；CSCs異體成瘤富集)。其中最為常用及可靠的方法就是利用CSCs表面標志物來進行篩選分離。研究發現，CSCs與一般的干細胞具有一些相似性(自我更新和多向分化)，最初用于分析成體干細胞的方法被用來研究CSCs。體內成瘤實驗是目前能用于CSCs鑒定的金標準。該方法包括評估CSCs在免疫缺陷小鼠中的成瘤能力。最初是用來檢測白血病。隨后，其應用被拓展到實體瘤，包括乳腺癌、結腸癌、卵巢癌、肺癌和頭頸癌。然而，體內成瘤實驗不僅昂貴，而且耗時，平均需要6個月，甚至更長時間。因此，需要一個有效而且廉價的體外實驗模型。腫瘤成球實驗被普遍用于各種CSCs相關的研究，常常作為體內成球實驗的替代方法。

近些年，隨著在不同腫瘤中更多CSCs相關標志物的發現，該方法不僅用于CSCs的分離鑒定，臨床診斷和基礎研究中，也在開發抗CSCs靶向治療的方法中，均具有非常好的前景。CSCs理論可能是目前生物醫學研究最具爭議的話題之一，近10年，出現了腫瘤干細胞、干細胞樣腫瘤細胞、腫瘤啟動細胞及腫瘤增殖細胞等多種命名方式。關于CSCs理論的爭議，主要集中在CSCs的來源，以及其表型和功能特征。最近一些CSCs相關的臨床試驗，取得了振奮人心的結果，初步證明針對CSCs治療方式的可行性。隨著對CSCs生物學了解的深入，功能分析模型的改善及在生物技術上的進步(基因表達譜分析、二代測序和高通量篩選)，靶向CSCs治療為復發性及對傳統治療方法耐受的腫瘤提供了非常有潛力的治療手段。CSCs驅使腫瘤的侵襲和復發，因此鑒別和純化CSCs是CSCs研究中的關鍵。

盡管分析細胞表面標志物是一種非常方便鑒別方法，但其可靠性依賴于所選擇的標志物是否穩定、普遍和特異，在CSCs鑒別中受腫瘤表型和基因的異質性的影響。因此，在過去的10年間，研究者盡管發現了通過腫瘤不同的表面標志物的組合能成功檢測和分離不同類型的CSCs，但在臨床上將該方法標準化還是一個極大的挑戰。

發明內容

本發明的目的在于提供一種人卵巢癌干細胞富集及流式分選的方法。