[發明專利]一種人卵巢癌干細胞富集及流式分選的方法

在審

• 申請號: 202010056543.0
• 申請日: 2020-01-18
• 公開（公告）號: CN111254116A
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 陳智毅;劉付春;余金穗;李悅;王奕;張輝;屠佳偉
• 申請（專利權）人: 廣州醫科大學附屬第三醫院（廣州重癥孕產婦救治中心;廣州柔濟醫院）
• 主分類號: C12N5/095
• 分類號: C12N5/095;C12N5/02;G01N15/14
• 代理公司: 廣州凱東知識產權代理有限公司 44259
• 代理人: 姚迎新

1.一種人卵巢癌干細胞富集及流式分選的方法，其特征在于：

包括如下步驟：

(1)富集卵巢癌A2780成球細胞；

(2)ALDEFLUOR^TMAssay流式分選卵巢癌干細胞，流式細胞儀設置和數據采集。

2.根據權利要求1所述的一種人卵巢癌干細胞富集及流式分選的方法，其特征在于：

所述步驟(1)采用無血清懸浮細胞培養法富集卵巢癌A2780成球細胞。

3.根據權利要求2所述的一種人卵巢癌干細胞富集及流式分選的方法，其特征在于：

所述步驟(1)無血清懸浮細胞培養法的詳細操作是：復蘇人卵巢癌A2780細胞株，使用完全培養基(含10％胎牛血清)中培養傳代，待其生長至貼壁面積達80％,使用0.05％胰酶/EDTA消化5分鐘，1000rpm離心5min,收集A2780細胞沉淀，使用無血清培養基重懸，無血清培養基含DMEM-F12、Glutamax^TM、丙酮酸鈉、B27、EGF、bFGF、胰島素，雙抗、預防支原體的藥物Plasmocin^TM及ROCK抑制劑Y27632，置于低吸附培養瓶進行連續懸浮培養，富集A2780細胞球，每3天添加一次2ml無血清培養基，每7天細胞傳代1次，培養過程中使用倒置顯微鏡觀察A2780細胞球富集情況，共培養三周。

4.根據權利要求1所述的一種人卵巢癌干細胞富集及流式分選的方法，其特征在于：

所述步驟(1)采用順鉑細胞培養法富集卵巢癌A2780成球細胞。

5.根據權利要求4所述的一種人卵巢癌干細胞富集及流式分選的方法，其特征在于：

所述步驟(1)順鉑細胞培養法的詳細操作是在完全培養基(含血清)中培養卵巢癌細胞A2780,待細胞長滿培養皿底部后，棄掉原培養基，用PBS洗2次，加入無血清培養基，加入順鉑，第二天繼續添加順鉑，第三天繼續添加順鉑，培養72小時后使用無血清培養基換液，用PBS洗2次，培養7天左右光鏡觀察A2780細胞成球形態。

6.根據權利要求4所述的一種人卵巢癌干細胞富集及流式分選的方法，其特征在于：

所述步驟(1)每次加入的順鉑的終濃度為0.5μg/ml。

7.根據權利要求1所述的一種人卵巢癌干細胞富集及流式分選的方法，其特征在于：

所述ALDEFLUOR^TMAssay流式分選卵巢癌干細胞的詳細操作是：

①激活ALDEFLUOR^TMAssay；

②細胞樣品制備：收集A2780懸浮培養細胞球到15ml離心管，離心(1000rpm，3min)；PBS沖洗一遍，離心(1000rpm，3min)；加入1ml TryplE^TMExpress胰酶重懸，槍頭輕柔吹打，消化為單細胞懸液，離心(1000rpm，3min)；PBS沖洗一遍，離心(1000rpm，3min)，使用ALDEFLUOR緩沖液重懸細胞，細胞密度調整為1×10⁶細胞/mL。

③ALDEFLUOR^TM測定：每個樣品管加入1ml細胞懸液，再加入5ul活化ALDEFLUOR^TM試劑到樣品管中，混勻后并立即將0.5ml的混合物轉移到陰性對照管，在陰性對照管中加入5μlDEAB試劑。37℃孵育樣品30-60min。孵育后,離心(250g，5min),棄上清；使用2％胎牛血清+2％雙抗ALDEFLUOR^TM檢測緩沖液1ml重懸，過200目篩網(以免團聚細胞堵塞流式濾嘴)，加入流式管中。整個過程冰上操作；流式分選前輕彈流式管使細胞分散；準備2支流式管，分別裝3ml無血清培養基(2％雙抗)，回收分選后細胞；

④流式細胞儀的設置和數據采集。