[發明專利]PCDA囊泡結合CRISPR的快速檢測系統及其方法

在審

• 申請號: 202010054825.7
• 申請日: 2020-01-17
• 公開（公告）號: CN111304294A
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 李小剛;劉士忠
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院北京協和醫院;北京電子科技職業學院
• 主分類號: C12Q1/6816
• 分類號: C12Q1/6816;C12N9/22;C12N15/113
• 代理公司: 北京慧尚知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11743
• 代理人: 吉海蓮

本發明公開了一種PCDA囊泡結合CRISPR的快速檢測系統，所述系統包括檢測目標物質的試劑R1和R2，所述R1包含待檢測的物質或該物質的相關基團，所述R2包含靶DNA，Cas蛋白?sgRNA復合物和PCDA囊泡。本發明的檢測方法具有以下優勢：(1)測試無需特殊儀器，定性測定時僅憑肉眼可視；(2)操作簡單、快速，非均相測試，無需酶標記和分離；(3)方法靈敏，結果準確，且樣品處理簡單，檢測費用較低。

技術領域

本發明涉及生物醫藥技術領域，具體涉及PCDA(10,12-pentacosadiynoic acid,10,12-二十五碳二炔酸)囊泡結合CRISPR的快速檢測系統及其方法。

背景技術

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,成簇規律間隔短回文重復序列)是原核生物基因組內的一段重復序列，是生命進化歷史上，細菌和病毒進行斗爭產生的免疫武器。簡單說就是，病毒能把自己的基因整合到細菌，利用細菌的細胞工具為自己的基因復制服務，細菌為了將病毒的外來入侵基因清除，進化出CRISPR-Cas9系統，利用這個系統，細菌可以不動聲色地把病毒基因從自己的基因組上切除，這是細菌特有的免疫系統。

博德研究所(Broad Institute)是隸屬美國麻省理工學院(MIT)和哈佛大學的一個高水平基因組學研究中心，該研究所的張峰團隊正在努力開發CRISPR-Cas13分子診斷技術。與用于基因編輯的Cas9蛋白不同，Cas13蛋白在切割靶序列后會不加選擇地切割所碰到的RNA—“附帶切割”(collateral cleavage)；這一特性使其不能被用于基因編輯，但對診斷來說卻是個福音，該切割能增加檢測信號的靈敏度。2018年，他們把這種診斷技術命名為SHERLOCK(specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking,特異性高靈敏度酶促解鎖)，該系統包含Cas13、對應的靶向待檢測病毒的sgRNA和包含一個切割后可發出熒光的報告RNA鏈；當這些Cas13蛋白識別到靶向RNA鏈時會切割相應的模板，隨后激活了它的“附帶切割”活性，進而切割報告RNA并釋放可檢測的熒光信號。

加州大學伯克利分校的Doudna團隊發現當Cas12a蛋白在剪切靶向的dsDNA后能高效地切割非特異性單鏈DNA(ssDNA)，基于此開發了DETECTR(DNA endonuclease targetedCRISPR trans reporter,DNA內切酶靶向CRISPR反向報告)技術；該系統包含Cas12a、靶向特定序列的sgRNA和非特異性ssDNA熒光報告序列(FQ-labeled reporter)。一旦Cas12a檢測到目的DNA序列便會切割靶序列，接著熒光報告序列也會被切割，從而釋放出熒光信號。目前CRISPR診斷主要用于分子診斷，包括病毒、微生物、cfDNA等。

聚聯乙炔(polydiacetylenes,PDA)囊泡由于其特殊的光學性質受到廣泛關注。聯乙炔(diacetylenes)也稱二乙炔或丁二炔，由于自身是兩親分子，其會以囊泡的形式存在于溶液中，紫外光照射下聯乙炔分子中兩個相鄰炔基通過1，4-加成反應生成聚聯乙炔；可見光激發其分子骨架離域電子，使其產生π-π*躍遷，溶液顯示為藍色，紫外-可見光譜中最大吸收約為650nm。

聚聯乙炔(PDA)具有獨特的性能優勢，主要體現在以下幾方面：首先，PDA可以由聯乙炔如10,12-二十五碳二炔酸(PCDA)單體通過UV或γ輻射自組裝制備，在聚合期間不需要加入催化劑或引發劑，產物PDA聚合物純度很高；第二，受到特異性環境刺激時，藍色PDA囊泡溶液(最大吸收波長約640nm)可以變為紅色(最大吸收波長約550nm)，并且這種顏色轉變可以通過肉眼直接觀察到；第三，藍色狀態的PDA囊泡不具有熒光性能，而它們的紅色狀態是有熒光的，這使得聚聯乙炔更適用于開發熒光傳感器外界環境變化。