[發明專利]一種用于甲胎蛋白檢測的診斷試劑

在審

• 申請號: 202010054487.7
• 申請日: 2020-01-17
• 公開（公告）號: CN113138277A
• 公開（公告）日: 2021-07-20
• 發明（設計）人: 蘭萍;葛云;曾凡明;楊毅
• 申請（專利權）人: 武漢戴安生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/574;G01N33/543;C07K16/18
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本發明公開了一種用于甲胎蛋白檢測的診斷試劑，通過制成甲胎蛋白膠乳試劑盒，通過膠乳增強免疫比濁法的方式進行正檢測，通過在均相的液體系統中，抗原抗體發生結合，當結合比例合適時，會形成固體的免疫復合物從液相析出，表現為濁度的變化。通過全自動生化分析儀檢測這種濁度變化，利用標準品繪制線性曲線，從而得出樣品中待測物質的含量，具有方便、快捷、節省時間、自動化操作，靈敏，準確等優點，可以滿足臨床大樣本檢測的需求。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種用于甲胎蛋白檢測的診斷試劑。

背景技術

甲胎蛋白(α-fetoprotein,αFP或AFP)是一種糖蛋白，正常情況下，這種蛋白主要來自胚胎的肝細胞，在成人血清中含量極低。甲胎蛋白與肝癌及多種腫瘤的發生發展密切相關，在多種腫瘤中均可表現出較高濃度，可作為多種腫瘤的陽性檢測指標。目前臨床上主要作為原發性肝癌的血清標志物，用于原發性肝癌的診斷及療效監測，作為目前惟一推薦在臨床常規使用的肝細胞癌腫瘤標志物，臨床建議乙型肝炎性或丙型肝炎性肝硬化患者，須每6個月隨訪檢查AFP， AFP＞20ng/ml且持續增加者，即使腹部超聲檢查陰性，也須進一步的檢查。其他惡性腫瘤如睪丸癌、畸胎癌、胃癌、胰腺癌等也可以導致AFP水平升高。因此，臨床上對高靈敏度和特異性的AFP診斷試劑盒存在較大需求。

傳統的LETIA是采用多克隆抗體包被膠乳粒子進行檢測，但是多克隆抗體可以識別抗原的多種表位，產生非特異性結合抗體，導致反應背景較高，影響檢測的特異性；由于動物個體差異，多克隆抗體容易產生批次差。

發明內容

本發明的目的在于：為了解決成本高、檢測速度慢和準確度低的問題，而提出的一種用于甲胎蛋白檢測的診斷試劑。

為了實現上述目的，本發明采用了如下技術方案：甲胎蛋白檢測的診斷試劑制備包括以下步驟：

S1：甲胎蛋白小鼠單克隆抗體的制備；

(1)、動物免疫：購買純度95％的人AFP蛋白，與納米佐劑混勻，免疫8 周齡Balb/C小鼠3只。采用背部多點注射的方法進行免疫，主注射100ug抗原/ 只實驗小鼠，加強注射50ug抗原/只實驗小鼠。免疫5次后，間接ELISA檢測效價，選擇效價最高的小鼠進行融合；

(2)、骨髓瘤細胞制備：融合前一周，復蘇SP2/0細胞，正常培養至對數期；

(3)、脾細胞制備：選定要融合的小鼠，融合當天用頸椎脫臼法處死，取脾，標準流程收集脾細胞并計數；

(4)、細胞融合：1)按1:3-1：10的比例混合骨髓瘤細胞和脾細胞，標準流程進行細胞融合操作，隨后用HAT DMEM完全培養基培養，融合后3天即可以看到雜交瘤細胞，第7天換1/2HAT完全培養基，第8天換1/2HT培養基。融合后10天左右開始進行篩選檢測，融合后用HAT選擇性培養基培養，顯微鏡下觀察，看到多個生長的雜交瘤細胞，證明融合操作成功。；2)吸取細胞上清100ul/ 孔進行間接ELISA檢測。根據ELISA結果，判斷陽性孔，用單道移液器挑檢整板檢測出的陽性孔，進行第二次復檢，進一步確認陽性孔；3)對復篩的陽性孔細胞做兩輪亞克隆。第一次亞克隆有限稀釋陽性孔中細胞，至多個孔中，加HT DMEM 培養基培養，7天左右在顯微鏡下觀察，間接ELISA檢測有克隆生長的孔，取OD 值高的孔為陽性孔；挑取陽性孔的細胞進行第二次亞克隆，檢測出穩定陽性的雜交瘤細胞株，作為最終制備單抗的細胞，并擴大培養；4)將上述陽性細胞擴大培養并注射至Balb/C小鼠(經弗氏不完全佐劑至敏)的腹腔，一般7-10日可見小鼠腹部隆起即代表有腹水產生。當小鼠有明顯腹水產生時及時抽取腹水；5) 將上述細胞的腹水，用ProteinA/G柱純化，純化后抗體純度大于90％。檢測濃度純度后，調整濃度以利于保存。

S2：甲胎蛋白單克隆抗體兩兩配對；