[發明專利]一種用于甲胎蛋白檢測的診斷試劑

在審

• 申請號: 202010054487.7
• 申請日: 2020-01-17
• 公開（公告）號: CN113138277A
• 公開（公告）日: 2021-07-20
• 發明（設計）人: 蘭萍;葛云;曾凡明;楊毅
• 申請（專利權）人: 武漢戴安生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/574;G01N33/543;C07K16/18
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1.一種用于甲胎蛋白檢測的診斷試劑，其特征在于，甲胎蛋白檢測的診斷試劑制備包括以下步驟：

S1：甲胎蛋白小鼠單克隆抗體的制備；

(1)、動物免疫：購買純度95％的人AFP蛋白，與納米佐劑混勻，免疫8周齡Balb/C小鼠3只。采用背部多點注射的方法進行免疫，主注射100ug抗原/只實驗小鼠，加強注射50ug抗原/只實驗小鼠。免疫5次后，間接ELISA檢測效價，選擇效價最高的小鼠進行融合；

(2)、骨髓瘤細胞制備：融合前一周，復蘇SP2/01細胞，正常培養至對數期；

(3)、脾細胞制備：選定要融合的小鼠，融合當天用頸椎脫臼法處死，取脾，標準流程收集脾細胞并計數；

(4)、細胞融合：1)按1:3-1：10的比例混合骨髓瘤細胞和脾細胞，標準流程進行細胞融合操作，隨后用HAT DMEM完全培養基培養，融合后3天即可以看到雜交瘤細胞，第7天換1/2HAT完全培養基，第8天換1/2HT培養基。融合后10天左右開始進行篩選檢測，融合后用HAT選擇性培養基培養，顯微鏡下觀察，看到多個生長的雜交瘤細胞，證明融合操作成功；2)吸取細胞上清100ul/孔進行間接ELISA檢測。根據ELISA結果，判斷陽性孔，用單道移液器挑檢整板檢測出的陽性孔，進行第二次復檢，進一步確認陽性孔；3)對復篩的陽性孔細胞做兩輪亞克隆。第一次亞克隆有限稀釋陽性孔中細胞，至多個孔中，加HT DMEM培養基培養，7天左右在顯微鏡下觀察，間接ELISA檢測有克隆生長的孔，取OD值高的孔為陽性孔；挑取陽性孔的細胞進行第二次亞克隆，檢測出穩定陽性的雜交瘤細胞株，作為最終制備單抗的細胞，并擴大培養；4)將上述陽性細胞擴大培養并注射至Balb/C小鼠(經弗氏不完全佐劑至敏)的腹腔，一般7-10日可見小鼠腹部隆起即代表有腹水產生。當小鼠有明顯腹水產生時及時抽取腹水；5)將上述細胞的腹水，用ProteinA/G柱純化，純化后抗體純度大于90％。檢測濃度純度后，調整濃度以利于保存。

S2：甲胎蛋白單克隆抗體兩兩配對；

(1)、生物素標記操作流程：1)將純化好的AFP單抗在2-8℃下用碳酸鹽緩沖液(0.1ML，NaHCO3/Na2CO3，pH9.5，含有0.1％NaN3)反復透析三次，透析結束后，調整免疫球蛋白濃度至20mg/mL；2)用DMSO(二甲亞砜)溶解NHS-D-Biotin，避光操作，將NHS-D-Biotin濃度調整至22mg/mL，分裝成小管，-20°保存；3)按待標記抗體與NHS-D-Biotin體積比10:1的比例進行混合。室溫避光，溫和攪拌，反應4h；4)將反應后的溶液在2-8℃下用PBS緩沖液(0.01M磷酸鹽溶液，0.15M氯化鈉溶液，pH7.4，含有0.1％NaN3)反復透析三次；5)透析結束后，-20℃保存生物素化抗體。

(2)、單抗配對：1)用未標記抗體(Cap-ab)包被板條，稀釋度1：1000，100ul/孔，4℃過夜；2)甩出包被液，用洗滌液洗2-3次(300uL/孔)，倒去洗滌液，輕拍10次，確保孔內無殘留液；3)加封閉液(300uL/孔)封閉板條，37℃密封2小時，甩出封閉液，洗滌液洗2次；4)加入抗原，陽性檢測板50ng/孔，空白對照板不加抗原，用稀釋液代替(0ng/孔)，37°孵育1h；甩出板內液體，洗滌液洗4次；5)加生物素標記的檢測抗體(Det-ab)，稀釋度1:1000，100uL/孔，37℃孵育1h；甩出板內液體，洗滌液洗4次；6)加二抗，將HRP標記的鏈霉親和素1:10000稀釋后，加入孔中，100uL/孔，37℃孵育1h；甩出板內液體，洗滌液洗4次；

(3)、得出單抗配對結論。

S3：甲胎蛋白膠乳增強試劑盒的制備

(1)、膠乳R2制備流程：1)取粒徑為270nm的羧基膠乳微球，用活化試劑MES(pH6.0.50mmol)清洗1ml微球(100mg/ml)兩次，每次用5ml溶液清洗；第二次活化后將微球重懸在4.5ml的活化試劑中，確保微球被均勻分散；2)邊混勻邊加入2mg EDAC(終濃度0.4mg/ml,溶于pH6.0，0.50mmol MES)和9mg NHS(終濃度1.8mg/m，溶于pH6.0，0.05M MES溶液)；3)混勻反應60min(18～37度)；4)使用H6.0，0.05M MES溶液清洗兩次(離心速度15000轉，20min)，最后懸浮在5ml的pH6.0，0.50mmol MES，確保微球分散均勻；5)加入適量抗體，混合微球與蛋白，室溫混合反應2～4小時；6)加入封閉試劑Gly終濃度40mM,乙醇胺終濃度40mM,混合反應60分鐘；加入BSA，終濃度1％，過夜反應；7)pH7.4 PBS+0.1％吐溫溶液，清洗微球三次，每次超聲分散好微球；8)將微球懸浮在PBS+0.1％吐溫溶液中，0.01％防腐劑，1％BSA,溫度4℃保存；

(2)制成甲胎蛋白膠乳試劑盒。