[發明專利]一種腫瘤抗原負載的DC-CIK細胞培養方法

有效

• 申請號: 202010053867.9
• 申請日: 2020-01-17
• 公開（公告）號: CN111117961B
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 莫毅;梁紅;吳曼惠
• 申請（專利權）人: 南寧摩米生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N5/0784
• 代理公司: 廣西咕咕狗專利代理事務所(普通合伙) 45137
• 代理人: 朱志寬

1.一種腫瘤抗原負載的DC-CIK細胞培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）制備腫瘤抗原；

（2）CIK細胞培養；

（3）DC細胞培養；

（4）DC-CIK細胞培養；

其中，制備腫瘤抗原包括以下步驟：

（1-1）取患者手術切除后的腫瘤組織100g，在無菌條件下用生理鹽水清洗干凈后用手術剪刀將其剪碎，加入ALys505N-0 培養基充分研磨；

（1-2）用4200目過濾網過濾收集單細胞懸浮液，1500r/min離心5min后用ALys505N-0培養基重懸腫瘤細胞至1-2×10⁷個/mL，裝入5mL至凍存管中；

（1-3）充分裂解腫瘤細胞；

（1-4）將腫瘤細胞裂解物加入離心管，3000r/min離心處理10min，收取上清，過濾，所得上清即為腫瘤抗原；將所得腫瘤抗原在-80℃下保存，備用；

CIK細胞培養包括以下步驟：

（2-1）取腫瘤患者外周血50-60mL，利用淋巴細胞分離密度梯度離心法分離出PBMC；

（2-2）將步驟（2-1）所得PBMC細胞用ALys505N-0 培養基洗滌一次，所得PBMC細胞濃度需為3-5×10⁷個/mL；

（2-3）用ALys505N-0 培養基將步驟（2-2）所得的PBMC的細胞濃度調整為1-2×10⁶個/mL后置于T175培養瓶中，轉移至培養箱中培養；

（2-4）2h后將T175培養瓶從培養箱中拿出，取另外一個T75培養瓶將懸浮細胞收集，加入1000IU/ml IFN-γ培養；

（2-5）24h后添加50ng/ml CD3單克隆抗體和1000IU/ml IL-1α進行增殖培養；

（2-6）每2-3d添加一倍的培養基培養，直至第7d時收獲CIK細胞；

DC細胞培養包括以下步驟：

（3-1）取步驟（2-4）中的貼壁細胞，加入500-1000IU/ml GM-CSF和500IU/ml IL-4，并用ALys505N-0 培養基調整細胞濃度為1-2×10⁶個/mL，放入培養箱中培養；

（3-2）每3d半量換液，并按照步驟（3-1）中濃度補充GM-CSF和IL-4；培養至第5d時，加入所制備的腫瘤抗原對DC進行抗原肽負載；

（3-3）培養至第6d時加入500IU/ml TNF-a 誘導DC細胞成熟，在培養的第7d時收獲DC細胞；

DC-CIK細胞培養包括以下步驟：

（4-1）將步驟（2-6）收獲的CIK細胞和步驟（3-3）收獲的DC細胞按10：1混合置于含500IU/ml IL-2的ALys50N-0 培養基中進行培養，每3d補加含500IU/ml IL-2的ALys50N-0培養基；

（4-2）培養至第15天時收獲DC-CIK細胞。

2.根據權利要求1所述的DC-CIK細胞培養方法，其特征在于，步驟（1-3）的具體操作為：將凍存管浸入液氮中速凍，10min后取出放入37℃水中速溶5min，如此重復3-5次。

3.根據權利要求1所述的DC-CIK細胞培養方法，其特征在于，步驟（3-2）中腫瘤抗原的添加量為50mg/mL。