[發明專利]敲除斑馬魚slc26a4基因的方法

在審

• 申請號: 202010053090.6
• 申請日: 2020-01-17
• 公開（公告）號: CN111154758A
• 公開（公告）日: 2020-05-15
• 發明（設計）人: 謝鼎華;賴若沙;謝華平;付貴芳;楊曙;曾婷;謝繽靈;鄧慧玲;胡昱瑤
• 申請（專利權）人: 中南大學湘雅二醫院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90;C12N15/89;A01K67/027;A01K67/02
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 溫可睿

本發明涉及基因敲除技術領域，尤其涉及敲除斑馬魚slc26a4基因的方法。本發明通過CRISPR/Cas9基因編輯技術，在斑馬魚slc26a4基因上設計合適的打靶位點，在體外合成特異性sgRNA和Cas9?mRNA用于斑馬魚的基因編輯。本發明能更高效且更精確地沉默特定基因，且制作簡單、成本低，且可同時對靶基因上多個位點進行剪切，沉默任意數目的單個基因，本發明還提供了基因敲除選育slc26a4基因缺失型斑馬魚的方法，該方法構得的斑馬魚模型，有助于進一步揭示人類大前庭水管癥發生的整個過程以及調控這個過程的分子機制，在醫學上對前庭水管癥病理的理解和新的治療方案的研發中具有十分重要的意義。

技術領域

本發明涉及基因敲除技術領域，尤其涉及敲除斑馬魚slc26a4基因的方法。

背景技術

slc26a4基因位于斑馬魚第4號染色體上，包含20個外顯子和19個內含子， cDNA全長2390bp，編碼760氨基酸，slc26a4編碼一種陰離子轉運膜蛋白，即 pendrin蛋白。pendrin蛋白是陰離子轉運家族slc26中的一員，主要介導Cl-，HCO3-,OH-,I-和甲酸鹽的轉運，SLC26A4基因突變與Pendred綜合征(PDS)(前庭水管擴大或伴內耳畸形神經性聾和甲狀腺腫)和大前庭水管綜合征(EVA)有密切的關系，發現slc26a4在人類胚胎早期的多個組織中都有表達，特別是內耳中強烈表達。

斑馬魚與人類內耳發育過程中的基因、信號通路有高度同源性，且slc26a4 基因進化上較為保守，研究發現slc26a4在斑馬魚胚胎早期表達量特別高。而且，與其他動物模型相比，斑馬魚具有個體小、易于飼養、發育快、繁殖能力強、體外受精、胚胎體外發育且透明等優點。因此，通過干擾掉斑馬魚體內的slc26a4基因，并且通過遺傳學手段研究其功能，有助于進一步揭示人類大前庭水管癥發生的整個過程以及調控這個過程的分子機制，在醫學上對前庭水管癥病理的理解和新的治療方案的研發中具有十分重要的意義。

基因打靶技術起源于20世紀80年代末，是一種通過對基因組進行定點修飾來研究基因功能的重要方法手段，也可用于治療人類的各種遺傳性疾病。該技術主要是利用缺失突變、基因滅活、染色體大片段刪除以及外源基因導入等方式來改變生物的遺傳信息，并且在生殖系中穩定遺傳后表達突變性狀，從而研究生物體內特定基因在生長發育過程中的作用，所以這類技術手段已成為現代分子生物學研究熱點。傳統的基因打靶技術是建立在胚胎干細胞(ESC)和同源重組技術的基礎之上，故打靶技術效率極低。2013年初，一種全新的人工核酸內切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9，能更高效且更精確地在生物體基因組中沉默特定基因，且制作簡單、成本低，且可同時對靶基因上多個位點進行剪切，沉默任意數目的單個基因。

但是目前通用的檢測CRISPR/Cas9突變方法應用于斑馬魚的基因敲除存在一定的缺陷，例如：在F0代對斑馬魚進行剪尾，并且做TA克隆，Sanger測序，需要花費大量的時間、試劑以及測序成本，并且F0代測序得到的不一定能夠遺傳到下一代。并且，CRISPR/Cas9技術所需的步驟較多，成本太高，脫靶率相對也較高。

發明內容

有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供敲除斑馬魚slc26a4基因的方法，該方法采用cloning free策略進行斑馬魚slc26a4基因的敲除，脫靶率較低。

本發明提供了靶向斑馬魚slc26a4基因的gRNA，包括啟動子元件、靶序列和骨架序列；其中，靶序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

本發明所述啟動子元件的序列如SEQ ID NO:3所示；所述骨架序列如 SEQ ID NO:4所示。

在一些具體實施例中，所述靶向斑馬魚slc26a4基因的gRNA包括SEQ ID NO:5～6所示的兩條gRNA。