[發明專利]敲除斑馬魚slc26a4基因的方法

在審

• 申請號: 202010053090.6
• 申請日: 2020-01-17
• 公開（公告）號: CN111154758A
• 公開（公告）日: 2020-05-15
• 發明（設計）人: 謝鼎華;賴若沙;謝華平;付貴芳;楊曙;曾婷;謝繽靈;鄧慧玲;胡昱瑤
• 申請（專利權）人: 中南大學湘雅二醫院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90;C12N15/89;A01K67/027;A01K67/02
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 溫可睿

1.靶向斑馬魚slc26a4基因的gRNA，包括啟動子元件、靶序列和骨架序列；其中，靶序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

2.根據權利要求1所示的gRNA，其特征在于，所述啟動子元件的序列如SEQ ID NO:3所示；所述骨架序列如SEQ ID NO:4所示。

3.根據權利要求1所示的gRNA，其特征在于，包括SEQ ID NO:5～6所示的兩條gRNA。

4.靶向斑馬魚slc26a4基因的敲除試劑，其特征在于，包括權利要求1～3任一項所述的gRNA和Cas9 mRNA。

5.根據權利要求4所述的敲除試劑，其特征在于，敲除試劑中包括Nuclease free H₂O和如下濃度的：

MgCl₂ 10mmol/L；

Cas9 mRNA 150ng/μL；

gRNA 各20ng/μL。

6.權利要求4或5所述的敲除試劑在構建slc26a4基因缺失型斑馬魚模型中的應用。

7.一種構建slc26a4基因缺失型斑馬魚模型的方法，其特征在于，將權利要求4或5所述的敲除試劑接入一細胞期的斑馬魚受精卵內，孵化獲得slc26a4基因缺失型斑馬魚模型。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，每個受精卵給予1.5～2.0nL權利要求4或5所述的敲除試劑。

9.根據權利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述孵育后還包括篩選的步驟；所述篩選包括：對受精36h后的胚胎進行篩選，或對成魚進行篩選；

所述篩選包括對基因組DNA進行擴增后進行Sanger測序或根據電泳結果進行篩選；擴增產物包含473bp和328bp大小的條帶則slc26a4基因缺失，擴增產物僅有473bp大小的片段則slc26a4基因未缺失；所述擴增的引物序列如SEQ ID NO:7～8所示。

10.根據權利要求7～9任一項所述的方法，其特征在于，所述孵化獲得的slc26a4基因缺失斑馬魚為F0代；所述方法還包括傳代的步驟；

F1代斑馬魚由F0代斑馬魚與野生型的斑馬魚雜交獲得；

F2代斑馬魚由F1代突變體雜交獲得。