[發明專利]一種間充質干細胞分泌素的制備方法

在審

• 申請號: 202010052195.X
• 申請日: 2020-01-17
• 公開（公告）號: CN111172105A
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 阮光萍;姚翔;潘興華;龐榮清
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二〇醫院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12P1/00
• 代理公司: 昆明盈正知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 53208
• 代理人: 李巋

本發明公開了一種間充質干細胞分泌素的制備方法，將間充質干細胞接種在培養基中，進行恒溫培養，溫度在37℃，在24～48h后，能夠獲得培養好的間充質干細胞懸液，將培養好的間充質干細胞懸液放到間充質干細胞培養基液中混合均勻，轉入生物反應器中通過培養液對干細胞進行培養，靜置培養通過向生物反應器中注入細胞培養基底液和磷酸鹽緩沖液可以稀釋生物反應器中的培養液,達到安全地持續刺激間充質干細胞細胞分泌蛋白的作用，從而能提高充質干細胞細胞分泌素的產量。

技術領域

本發明涉及分泌素的制備方法，尤其是涉及一種間充質干細胞分泌素的制備方法。

背景技術

間充質干細胞是一種多能干細胞，它具有干細胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。在臨床應用也最多，與造血干細胞聯合應用，可以提高移植的成功率，加速造血重建。當患者接受大劑量化療后，將間充質干細胞與造血干細胞一同輸入，可明顯加速患者血細胞恢復時間，且安全無不良反應。間充質干細胞臨床應用于解決多種血液系統疾病，心血管疾病，肝硬化，神經系統疾病，膝關節半月板部分切除損傷修復，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了更多病患的生命。此外，間充質干細胞在神經系統修復及更多方面具有長遠的發展前景。間充質干細胞是干細胞的一個研究分支，干細胞是一類具有自我復制和多向分化能力的細胞，它們可以不斷地自我更新，并在特定條件下轉變成為一種或多種構成人體組織或器官的細胞。干細胞是機體的起源細胞，是形成人體各種組織器官的始祖細胞。

間充質干細胞不僅存在于骨髓中，也存在于骨骼肌、骨外膜和骨小梁中。由于它分化的組織類型十分廣泛，因此臨床應用價值不菲。雖然間充質干細胞分泌素的市場潛力很大,但是其大量培養存在較大的困難，主要表現為干細胞在生長時所需要較大的表面積，且干細胞非常容易分化，因此急需一種間充質干細胞分泌素的制備方法。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有的缺陷，提供一種間充質干細胞分泌素的制備方法，從而解決上述問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種間充質干細胞分泌素的制備方法，具體的包括以下步驟：

S1：將間充質干細胞接種在培養基中，進行恒溫培養，溫度在37℃，在 24～48h后，能夠獲得培養好的間充質干細胞懸液，將培養好的間充質干細胞懸液放到間充質干細胞培養基液中混合均勻，轉入生物反應器中通過培養液對干細胞進行培養，靜置培養；

S2：生物反應器中培養2～5h后以30～50r/min的速度均勻攪拌1～2h，并在37℃的恒溫狀態下，內部氣體含量為5％CO2和10％～20％O2的條件下培養10～20天，從而獲得間充質干細胞基液，生物反應器內部環境壓強恒定為一個標準大氣壓；

S3：在生物反應器中將S1所得的干細胞以磷酸緩沖液2～4次，然后向生物反應器中加入基礎培養液DMDM/F12與磷酸緩沖液繼續培養12～24h，收集生物反應器中的上清液，得到分泌素原液；

S4：獲得的間充質干細胞分泌素原液經70μm孔徑細胞濾器過濾后得濾液，然后將濾液1500g速度離心10分鐘，取上清液，上清液通過冷凍干燥制得凍干粉末，即獲得間充質干細胞分泌素。

作為本發明的一種優選技術方案，所述步驟S3中細胞培養基包括基礎培養基DMDM/F12和添加劑:其中，添加劑為1～5mg/mL人白蛋白、40～60μg/mL 維生素C和2～6mg/mL人參皂苷單體Rbl，在進行培養時，每過12個小時向著培養液的內部按照培養液和白血病抑制因子5:1的比例添加白血病抑制因子，白血病抑制因子能夠避免干細胞的分化。

作為本發明的一種優選技術方案，所述S3中對干細胞進行清洗時，磷酸緩沖液的濃度為0.01M，pH值為7.4，基礎培養液DMDM/F12與磷酸緩沖液的體積比為1:4，磷酸鹽緩沖液通過管道緩慢的通入生物反應器中，管道的側壁與生物反應器內腔側壁相貼合，管道的中液體的沖力使得生物反應器中的混合液旋轉。