[發明專利]一種間充質干細胞分泌素的制備方法

在審

• 申請號: 202010052195.X
• 申請日: 2020-01-17
• 公開（公告）號: CN111172105A
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 阮光萍;姚翔;潘興華;龐榮清
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二〇醫院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12P1/00
• 代理公司: 昆明盈正知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 53208
• 代理人: 李巋

1.一種間充質干細胞分泌素的制備方法，其特征在于：具體的包括以下步驟：

S1：將間充質干細胞接種在培養基中，進行恒溫培養，溫度在37℃，在24～48h后，能夠獲得培養好的間充質干細胞懸液，將培養好的間充質干細胞懸液放到間充質干細胞培養基液中混合均勻，轉入生物反應器中通過培養液對干細胞進行培養，靜置培養；

S2：生物反應器中培養2～5h后以30～50r/min的速度均勻攪拌1～2h，并在37℃的恒溫狀態下，內部氣體含量為5％CO2和10％～20％O2的條件下培養10～20天，從而獲得間充質干細胞基液，生物反應器內部環境壓強恒定為一個標準大氣壓；

S3：在生物反應器中將S1所得的干細胞以磷酸緩沖液2～4次，然后向生物反應器中加入基礎培養液DMDM/F12與磷酸緩沖液繼續培養12～24h，收集生物反應器中的上清液，得到分泌素原液；

S4：獲得的間充質干細胞分泌素原液經70μm孔徑細胞濾器過濾后得濾液，然后將濾液1500g速度離心10分鐘，取上清液，上清液通過冷凍干燥制得凍干粉末，即獲得間充質干細胞分泌素。

2.根據權利要求1所述的一種間充質干細胞分泌素的制備方法，其特征在于：所述步驟S3中細胞培養基包括基礎培養基DMDM/F12和添加劑:其中，添加劑為1～5mg/mL人白蛋白、40～60μg/mL維生素C和2～6mg/mL人參皂苷單體Rbl，在進行培養時，每過12個小時向著培養液的內部按照培養液和白血病抑制因子5:1的比例添加白血病抑制因子，白血病抑制因子能夠避免干細胞的分化。

3.根據權利要求1所述的一種間充質干細胞分泌素的制備方法，其特征在于：所述S3中對干細胞進行清洗時，磷酸緩沖液的濃度為0.01M，pH值為7.4，基礎培養液DMDM/F12與磷酸緩沖液的體積比為1:4，磷酸鹽緩沖液通過管道緩慢的通入生物反應器中，管道的側壁與生物反應器內腔側壁相貼合，管道的中液體的沖力使得生物反應器中的混合液旋轉。

4.根據權利要求1所述的一種間充質干細胞分泌素的制備方法，其特征在于：所述間充質干細胞來源于骨髓、脂肪、皮膚、臍帶血、臍帶、胎盤中的一種或多種組合。

5.根據權利要求1所述的一種間充質干細胞分泌素的制備方法，其特征在于：所述S1采用的培養基為補充有10％胎牛血清和1％抗生素的改良Eagle培養基，即DMEM培養基。