[發(fā)明專利]一種結(jié)核分枝桿菌核酸適配子及其制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010051901.9
• 申請(qǐng)日: 2020-01-17
• 公開（公告）號(hào): CN111218449A
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳燕玲;冀俊峰;鄒國源
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海孚清生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/115
• 分類號(hào): C12N15/115;C12N15/10
• 代理公司: 合肥東邦滋原專利代理事務(wù)所(普通合伙) 34155
• 代理人: 張海燕

本發(fā)明涉及適配子技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種結(jié)核分枝桿菌核酸適配子，通過SELEX篩選方法得到結(jié)核分枝桿菌特異親和的適配子，其核苷酸序列SEQ ID NO：0所示；對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，篩選出SEQ ID NO：2?3。還公開了該種結(jié)核分枝桿菌核酸適配子的制備方法。本發(fā)明通過SELEX技術(shù)篩選出結(jié)核分枝桿菌高度特異親和的核酸適配子，對(duì)適配子進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，提高對(duì)菌株結(jié)合的親和性與特異性，利用熒光顯微分析儀觀察結(jié)核分枝桿菌的形態(tài)，并進(jìn)行計(jì)數(shù)，可以顯著提高菌種分析的靈敏度。此方法操作方法簡(jiǎn)單，對(duì)操作人員要求低，可以有效節(jié)約人力成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及適配子技術(shù)領(lǐng)域，涉及了一種結(jié)核分枝桿菌核酸適配子，還包括該種結(jié)核分枝桿菌核酸適配子的制備方法。

背景技術(shù)

結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)是結(jié)核病的病原菌，可侵犯全身各組織器官，但以肺部感染最多見。1980年代后，隨著艾滋病的流行、結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株的出現(xiàn)、免疫抑制劑的應(yīng)用、吸毒、貧困及人口流動(dòng)加劇等因素，全球范圍內(nèi)結(jié)核病的疫情驟然惡化。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全世界約每4個(gè)人中就有1個(gè)人感染了結(jié)核分枝桿菌，在某些發(fā)展中國家成人中結(jié)核分枝桿菌攜帶率高達(dá)80％，其中約5％～10％攜帶者可發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病。目前全球每年約出現(xiàn)1000萬結(jié)核新病例，并導(dǎo)致約170萬人死亡。我國每年死于結(jié)核病的人約25萬之多，是各類傳染病死亡人數(shù)總和的兩倍多。因此，結(jié)核病又成為了威脅人類健康的全球性衛(wèi)生問題，并成為某些發(fā)展中國家和地區(qū)，特別是艾滋病高發(fā)區(qū)人群的首要死因。世界衛(wèi)生組織和各國對(duì)結(jié)核病的發(fā)展形勢(shì)日益嚴(yán)峻重視。相比之下，人類對(duì)非結(jié)核分枝桿菌(NTM)所引起的感染，卻未充分認(rèn)識(shí)，也未被引起足夠重視。從我國歷次的結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，NTM分離率由1990年的4.9％上升至2000年的11.1％，到2010年的22.9％，基本反映了我國的NTM病呈明顯上升的態(tài)勢(shì)，已成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題。更為重要的是，NTM肺病臨床癥狀與體征極似肺結(jié)核病，同樣可產(chǎn)生咳嗽、咯痰、咯血、胸痛、氣急、盜汗、低熱、乏力、消瘦、萎靡不振等癥狀，在無菌種鑒定結(jié)果的情況下，可長(zhǎng)期被誤診為結(jié)核病。但兩種感染的治療用藥卻完全不同，NTM對(duì)許多抗結(jié)核藥物天然耐藥，且不同NTM菌種對(duì)藥物敏感性各不相同。目前常用痰標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法是痰涂片鏡檢法，其檢測(cè)靈敏度低(10000條/mL)，往往會(huì)導(dǎo)致部分病人會(huì)漏診，無法在第一時(shí)間獲得治療而流向社會(huì)。由于結(jié)核分枝桿菌空氣傳播的特性，在人群中必然成為無法識(shí)別、無法防范的傳染源。另外鏡檢法只能確認(rèn)是否感染分枝桿菌，無法鑒別結(jié)核分枝桿菌還是非結(jié)核分枝桿菌，容易造成誤診與錯(cuò)誤用藥，錯(cuò)過最佳的治療時(shí)間。痰結(jié)核分枝桿菌常規(guī)培養(yǎng)法即通過在鑒別培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，通過觀察細(xì)菌菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)溫度和色素，以及一系列的生化試驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)MTB和NTM的初步鑒定。該方法是鑒定細(xì)菌活性的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，但是操作比較繁瑣、費(fèi)時(shí)，需要4～8周時(shí)間，并受到菌量、菌齡的影響。此外，由于菌株易發(fā)生變異，出現(xiàn)非典型生物學(xué)特征，難以判斷生化反應(yīng)結(jié)果，而影響鑒定的準(zhǔn)確性。以基因檢測(cè)為診斷依據(jù)的結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定方法包括Souther blotter、PCR擴(kuò)增、RFLP、基因芯片、測(cè)序等。目前商品化的分枝桿菌菌種鑒定試劑盒都是以16S rDNA序列為檢測(cè)靶標(biāo)的。然而由于分枝桿菌某些菌種生長(zhǎng)比較慢，16S rDNA保守性比較強(qiáng)，以單一的16SrDNA為檢測(cè)靶標(biāo)時(shí)，需進(jìn)一步借助探針或測(cè)序的方法才能實(shí)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的鑒別診斷，而且操作復(fù)雜，檢測(cè)成本高，降低了在臨床上的廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供了一種結(jié)核分枝桿菌核酸適配子，還公開了該種結(jié)核分枝桿菌核酸適配子的制備方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案得以解決：

一種結(jié)核分枝桿菌核酸適配子，通過SELEX篩選方法得到結(jié)核分枝桿菌特異親和的適配子，其核苷酸序列SEQ ID NO：0所示。SEQ ID NO：0為GGGAGCTCAGTTTAAACGCTCAATAGTCAAGCGATTGATAGACGGGCTTTGACACGTGTTCGAAGGGCATGGGGGATC。