[發明專利]一種利用重組納豆芽孢桿菌提高維生素K2

有效

• 申請號: 202010051111.0
• 申請日: 2020-01-17
• 公開（公告）號: CN111549045B
• 公開（公告）日: 2023-09-19
• 發明（設計）人: 張廣華;劉云;陳立軍;阮月敏;區文彩;陸陽
• 申請（專利權）人: 西寶生物科技（上海）股份有限公司
• 主分類號: C12N15/67
• 分類號: C12N15/67;C12N15/75;C12P7/66;C12R1/07
• 代理公司: 上海三方專利事務所(普通合伙) 31127
• 代理人: 吳瑋

本發明公開了一種利用重組納豆芽孢桿菌提高維生素Ksubgt;2/subgt;產量的方法，通過組成型啟動子Psubgt;43/subgt;在納豆芽孢桿菌染色體上過表達氟他洛辛合成酶基因mqnA，在得到的菌株NA1的基礎上，利用Psubgt;43/subgt;啟動子在納豆芽孢桿菌染色體上過表達去氧黃嘌呤氟他洛辛合成酶的基因，在得到的菌株NA2的基礎上，利用Psubgt;hbs/subgt;啟動子替換納豆芽孢桿菌中O?琥珀酰苯甲酸?CoA連接酶基因的天然啟動子，在得到的菌株NA3的基礎上，用含有Psubgt;hbs/subgt;啟動子的來源于天藍色鏈霉菌的1,4?二羥基?6?萘甲酸合酶基因替換納豆芽孢桿菌染色體上的異分支酸基因，將所述重組菌的種子液按照3%~6%的接種量接種到發酵培養基中。本發明構建得到4株重組菌NA1~NA4，其中NA3~NA4使得維生素Ksubgt;2/subgt;的產量得到了顯著提高。

技術領域

本發明涉及遺傳工程技術領域，特別涉及一種利用重組納豆芽孢桿菌提高維生素K₂產量的方法。

背景技術

維生素K₂，是維生素K的活性體之一，是由一個甲基萘醌母環和n個異戊二烯側鏈連接而成的一類重要的脂溶性維生素，作為γ-谷氨酸羧化酶的輔因子，具有半衰期長，生物利用度好的特點。在抗動脈鈣化及骨關節炎，抗腫瘤，抗氧化、延緩衰老、美膚養顏，治療肝炎，調整消化道，緩解平滑肌痙攣，治療和預防骨質疏松癥，預防肝硬化進展為肝癌，治療維生素K₂缺乏性出血癥，利尿、強肝解毒，降低血壓等方面起到重要作用。由于七烯甲萘醌對人體具有更好的親和性和更長的半衰期，得到人們更多的關注。

維生素K是一系列化合物的總稱，其核心結構是2-甲基-1,4-甲萘醌環，但是側鏈結構的長度和飽和度有所不同。在納豆芽孢桿菌中，分支酸可以在mqn基因簇的作用下形成骨架結構甲萘醌，mqn基因簇主要包括mqnF，mqnD，ytxM，mqnC，mqnE，mqnB，yuxO?7個酶。然后在1,4-二羥基-2-萘甲酸七戊烯基轉移酶（mqnA）的作用下生成去甲基甲萘醌-7，最后在甲萘醌甲基轉移酶（mqnH）的作用下生成七烯甲萘醌。在自然界中合成核心結構主要包括兩種方式，一種是mqn基因簇，另一種是存在于少量細菌比如天藍色鏈霉菌（Streptomycescoelicolor）中的mqn基因簇。在Mqn基因簇中，主要包括mqna，mqnB，mqnC，mqnD四個基因。前體分支酸在Mqn基因簇的作用下能夠合成前體1,4-二甲基-萘甲酸，相較于mqn基因簇具有催化步驟小，減少中間代謝物消耗等優點。

納豆芽孢桿菌（Bacillus?subtilis）常被用在維生素K₂的生產中，其產品被FDA認證為“generally?regarded?as?safe”（GRAS）安全級別。因此，運用代謝工程手段構建重組納豆芽孢桿菌是高效合成維生素K₂的有效途徑。然而，維生素K₂的合成途徑十分復雜，且納豆芽孢桿菌合成維生素K₂的代謝流通量不足，將嚴重影響維生素K₂的合成。如何調整納豆芽孢桿菌代謝流供給，增加維生素K₂的合成是一個值得深入探討的問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用重組納豆芽孢桿菌提高維生素K₂產量的方法，以納豆芽孢桿菌（Bacillus?subtilis?natto）為出發菌株，利用P43啟動子在納豆芽孢桿菌的基因組上異源表達氟他洛辛合成酶基因mqnA和去氧黃嘌呤氟他洛辛合成酶基因mqnB；利用Phbs啟動子在染色體上表達O-琥珀酰苯甲酸-CoA連接酶基因mqnC和1,4-二羥基-6-萘甲酸合酶mqnD，構建得到4株重組菌NA1~NA4，其中NA3~NA4使得維生素K₂的產量得到了顯著提高，以解決上述背景技術中提出的問題。