[發(fā)明專利]一種利用重組納豆芽孢桿菌提高維生素K2

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010051111.0
• 申請(qǐng)日: 2020-01-17
• 公開（公告）號(hào): CN111549045B
• 公開（公告）日: 2023-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張廣華;劉云;陳立軍;阮月敏;區(qū)文彩;陸陽(yáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西寶生物科技（上海）股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/67
• 分類號(hào): C12N15/67;C12N15/75;C12P7/66;C12R1/07
• 代理公司: 上海三方專利事務(wù)所(普通合伙) 31127
• 代理人: 吳瑋

1.一種利用重組納豆芽孢桿菌提高維生素K₂產(chǎn)量的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1：構(gòu)建重組菌NA1

通過(guò)組成型啟動(dòng)子P₄₃在納豆芽孢桿菌染色體上過(guò)表達(dá)氟他洛辛合成酶基因mqnA，所述納豆芽孢桿菌為野生型；

步驟2：構(gòu)建重組菌NA2

在步驟1得到的菌株NA1的基礎(chǔ)上，利用P₄₃啟動(dòng)子在納豆芽孢桿菌染色體上過(guò)表達(dá)去氧黃嘌呤氟他洛辛合成酶mqnB的基因；

步驟3：構(gòu)建重組菌NA3

在步驟2得到的菌株NA2的基礎(chǔ)上，利用P_hbs啟動(dòng)子替換納豆芽孢桿菌中O-琥珀酰苯甲酸-CoA連接酶mqnC基因的天然啟動(dòng)子；

步驟4：構(gòu)建重組菌NA4

在步驟3得到的菌株NA3的基礎(chǔ)上，用含有P_hbs啟動(dòng)子的來(lái)源于天藍(lán)色鏈霉菌的1,4-二羥基-6-萘甲酸合酶mqnD基因替換納豆芽孢桿菌染色體上的異分支酸dhbB基因；

步驟5：菌株發(fā)酵生產(chǎn)維生素K₂

將所述重組菌NA4的種子液按照3%~6%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中；

其中，步驟1中所述重組菌NA1是Bacillus?subtilis?natto,?P₄₃-mqnA，其是在染色體amyE位點(diǎn)上插入一段序列，序列包括啟動(dòng)子P₄₃融合mqnA基因來(lái)增強(qiáng)氟他洛辛合成酶mqnA基因的表達(dá)，并將其命名為NA1；

其中，步驟2中所述重組菌NA2在NA1的基礎(chǔ)上還做了如下改造：利用P₄₃啟動(dòng)子在納豆芽孢桿菌染色體上過(guò)表達(dá)去氧黃嘌呤氟他洛辛合成酶mqnB的基因，得到菌株Bacillussubtilis?natto,?P₄₃-mqnA?P₄₃-mqnB，將其命名為NA2；

其中，步驟3中所述重組菌NA3在NA2的基礎(chǔ)上還做了如下改造：利用P_hbs啟動(dòng)子在納豆芽孢桿菌基因組上過(guò)表達(dá)O-琥珀酰苯甲酸-CoA連接酶mqnC的基因，得到Bacillussubtilis?natto,?P₄₃-mqnA?P₄₃-mqnB?P_hbs-mqnC，將其命名為NA3；

其中，步驟4中所述重組菌NA4在NA3的基礎(chǔ)上還做了如下改造：用含有P_hbs啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)1,4-二羥基-6-萘甲酸合酶mqnD基因替換納豆芽孢桿菌染色體上的異分支酸dhbB基因，得到菌株Bacillus?subtilis?natto,?P₄₃-mqnA?P₄₃-mqnB?P_hbs-mqnC?P_hbs-mqnD?ΔdhbB，將其命名為NA4；

所述P₄₃啟動(dòng)子的序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述P_hbs啟動(dòng)子的序列如SEQ?ID?NO.2所示；所述氟他洛辛合成酶基因mqnA的序列如SEQ?ID?NO.4所示；所述去氧黃嘌呤氟他洛辛合成酶mqnB的序列如SEQ?ID?NO.5所示；所述O-琥珀酰苯甲酸-CoA連接酶mqnC的序列如SEQ?IDNO.6所示；所述1,4-二羥基-6-萘甲酸合酶mqnD的基因序列如SEQ?ID?NO.7所示；所述異分支酸dhbB的序列如genebank?ID：936582所示。

2.如權(quán)利要求1所述的利用重組納豆芽孢桿菌提高維生素K₂產(chǎn)量的方法，所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方包括如下質(zhì)量百分比的原料：酵母提取物3%，大豆蛋白胨4%，葡萄糖3%和蔗糖2%。