[發明專利]雞ACE2基因的克隆、蛋白的表達和純化及其多克隆抗體的制備

在審

• 申請號: 202010049866.7
• 申請日: 2020-01-16
• 公開（公告）號: CN113122523A
• 公開（公告）日: 2021-07-16
• 發明（設計）人: 張源淑;紀曉霞;李帥;李志強;姜婉茹;閆書平;朱斌
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N9/48
• 分類號: C12N9/48;C12N15/57;C12N15/70;C07K16/40;C07K16/06
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本發明提供了雞ACE2基因的克隆、蛋白的表達和純化及其多克隆抗體的制備。提供了ACE2蛋白的氨基酸序列和基因序列，構建了ACE2原核表達載體，利用大腸桿菌原核表達系統表達ACE2蛋白，并對蛋白進行純化。純化后的蛋白能夠制備效價較高的多克隆抗體，并且本發明中的抗原和多克隆抗體可以為進一步開發檢測試劑盒奠定基礎。ACE2作為RAS系統的負調節分子，通過靶向降解AngII，發揮抗損傷、抗纖維化等機體保護功能；作為急性嚴重呼吸系統綜合征冠狀病毒(SARS?CoV)主要功能性受體，具有保護肺損傷的功能；ACE2協同氨基酸轉運載體轉運，與氨基酸吸收不良、腸道微生態平衡和胃腸道炎癥發揮重要作用。所以本發明無論是從基礎研究還是臨床運用上的意義都是十分重大的。

技術領域

本發明屬于分子克隆技術領域，具體涉及一種雞的新基因ACE2 (Angiotensinconverting enzyme 2)的克隆，蛋白的表達和純化以及多克隆抗 體的制備。

背景技術

血管緊張素轉換酶2(ACE2)是2000年發現的ACE同系物中的一員， 是腎素-血管緊張素系統的一個重要調節因子。屬于I型跨膜糖蛋白，一種含 鋅離子的單羧基肽糖蛋白酶。廣泛存在于動物的心臟、肝臟、肺臟、腎臟、 睪丸以及腸道等主要器官中。ACE2將血管緊張素II(AngII)降解為具有舒 張血管及抗增殖作用血管緊張素(1-7)[Ang(1-7)]，也可將血管緊張素I (AngI)降解為Ang(1-9)。Ang(1-7)通過其受體Mas(MasR)發揮抗 氧化、抗纖維化、抗炎等作用，引起了科研工作者的廣泛關注。

目前ACE2的研究集中在以下三個方面：ACE2作為RAS系統的負調 節分子，通過靶向降解AngII，發揮抗損傷、抗纖維化等機體保護功能；作 為急性嚴重呼吸系統綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)主要功能性受體，具有 保護肺損傷的功能；ACE2協同氨基酸轉運載體轉運，與氨基酸吸收不良、 腸道微生態平衡和胃腸道炎癥發揮重要作用。

人、小鼠、大鼠、貓、綿羊、豬以及斑馬魚等多種哺乳動物及水生動 物，哺乳動物的ACE2基因鑒定并證實。但在鳥類中，ACE2基因鮮有報道， 尤其是家禽雞的ACE2基因還未曾被注釋。

在本發明研究中，根據NCBI公布的預測的雞ACE2序列，首次通過 PCR擴增得到了雞的ACE2基因，利用原核表達系統表達了pET32a-ACE2

重組蛋白，通過純化pET32a-ACE2重組蛋白制備鼠抗ACE2血清多抗。 本發明研究填補了GenBank上缺乏雞ACE2全長序列的資料空白，為ACE2 在肉雞及禽類方面的研究提供了基礎資料。

有鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的目的是根據ACE2作為RAS系統的負調節分子，通過靶向降 解AngII，發揮抗損傷、抗纖維化等機體保護功能；作為急性嚴重呼吸系統 綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)主要功能性受體，具有保護肺損傷的功能； 協同氨基酸轉運載體轉運，與氨基酸吸收不良、腸道微生態平衡和胃腸道 炎癥所發揮的關鍵作用，以及到目前為止雞的ACE2基因還尚未被注釋， 克隆得到雞ACE2基因全長，不僅填補了GeneBank上缺乏雞ACE2全長序 列的資料空白，而且通過原核表達ACE2蛋白并制備相應的多克隆抗體， 還可以為ACE2在肉雞及禽類方面的研究提供基礎資料。

為實現上述目的，本發明采用以下的技術方案為：

一種雞的ACE2蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一種編碼上述雞的ACE2蛋白的基因，所述基因編碼如SEQ ID NO.1 所示的氨基酸序列，或所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一種雞的ACE2的連接載體或表達載體，所述連接載體或表達載體含 有如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。

一種雞的ACE2克隆載體或表達載體的制備方法，其包括以下步驟：