[發明專利]雞ACE2基因的克隆、蛋白的表達和純化及其多克隆抗體的制備

在審

• 申請號: 202010049866.7
• 申請日: 2020-01-16
• 公開（公告）號: CN113122523A
• 公開（公告）日: 2021-07-16
• 發明（設計）人: 張源淑;紀曉霞;李帥;李志強;姜婉茹;閆書平;朱斌
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N9/48
• 分類號: C12N9/48;C12N15/57;C12N15/70;C07K16/40;C07K16/06
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1.一種雞的ACE2蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一種編碼上述雞的ACE2蛋白的基因，其特征在于，所述基因編碼如權利要求1所述蛋白的氨基酸序列，或所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一種雞的ACE2的連接載體或表達載體，其特征在于，所述連接載體或表達載體含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

4.一種雞的ACE2克隆載體或表達載體的制備方法，其特征在于，其包括以下步驟：

S1、21日齡白羽肉雞，頸部放血處死后取心臟、肝臟、肺臟、腎臟、回腸、盲腸、空腸等，經生理鹽水漂洗后迅速放入液氮速凍。提取基因組RNA，使用隨機引物將RNA反轉錄為cDNA。設計ACE2的上下游引物用于ACE2全長基因擴增，并在ACE2基因片段兩側分別加入BamHI和HindIII兩個酶切位點，以cDNA為模板，擴增獲得ACE2基因全長。

S2、切膠純化目的片段，然后用TA克隆的方法將目的片段連接到pMD19T載體上，獲得質粒pMD19T-ACE2。

5.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，還包括步驟：

S3、分別用BamHI和HindIII酶切pET32a載體和pMD19T-ACE2質粒，切膠回收目的片段，利用T4連接的方法將目的片段連接到載體上，獲得質粒pET32a-ACE2。

6.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，在步驟S1中，所述ACE2引物的序列如SEQID NO.3、SEQ ID NO.3所示，擴增條件為：95℃5min；95℃20s，59℃20s，72℃1min15s，40個循環；72℃10min。

7.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，在步驟S2中，具體連接體系：取0.5uLpMD19-T載體，4.5uL純化產物，5uLSolutionI于200uLEP管中，混勻后在PCR儀器上運行16℃，14h，進行連接。

8.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，在步驟S3中，具體步驟為：用T4連接酶將pET32a載體回收產物和pMD-19T-ACE2重組質?；厥债a物進行連接，連接體系(10uL)；1uLpET32a載體，7uL目的序列，1uLT4連接酶，1uL10×Buffer于200uLEP管中，混勻后在PCR儀器上運行16℃，14h，進行連接，獲得質粒pET32a-ACE2。

9.一種雞的ACE2蛋白的制備方法，將權利要求5制備的雞的ACE2原核表達載體，轉入DH5α、BL21感受態細胞中，經IPTG誘導表達，KCL切膠純化獲得pET32a-ACE2重組蛋白。

10.一種抗ACE2蛋白多克隆抗體的制備，其包括如下步驟：將獲得權利要求9獲得的雞pET32a-ACE2重組蛋白免疫Wistar大鼠，接種方式為頸背部皮下多點注射，首免使用弗氏完全佐劑，分別于第二周進行一免，二免、三免和四免使用弗氏不完全佐劑，于加強免疫后7天取大鼠血清。