[發明專利]一種檢測牛冠狀病毒BCV的檢測試劑盒及使用方法

在審

• 申請號: 202010049187.X
• 申請日: 2020-01-16
• 公開（公告）號: CN111057795A
• 公開（公告）日: 2020-04-24
• 發明（設計）人: 郭志宏;張學勇;朵紅;付永;沈秀英;馬怡雋
• 申請（專利權）人: 青海省畜牧獸醫科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/93
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張晉

本發明公開一種檢測牛冠狀病毒BCV的檢測試劑盒及非疾病檢測的使用方法。本發明的一種用于檢測牛冠狀病毒BCV的檢測試劑盒內包括有擴增引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。本發明的檢測牛冠狀病毒BCV檢測試劑盒及使用方法能夠快速、特異的檢測牛冠狀病毒BCV。

技術領域

本發明涉及一種用于檢測特定病毒的試劑盒及這種試劑盒在非疾病檢測目的的使用方法，確切講本發明涉及一種檢測牛冠狀病毒BCV的檢測試劑盒及非疾病檢測的使用方法。

背景技術

牛冠狀病毒(Bovine Coronavirus,BCV)為不分段的單股正鏈RNA病毒，有囊膜。病毒粒子具有多形性，但基本呈球形，直徑為65～210nm，基因組大小為31043bp，主要編碼5種結構蛋白，從5′端到3′端依次為核衣殼蛋白(N,52kD)，膜蛋白(M,25kD)，小衣殼蛋白(E,8kD)，纖突蛋白(S,180kD)和血凝素酯酶蛋白(HE,65kD)。其中，N基因高度保守，常被用于BCV的核酸檢測和鑒定；雖然M蛋白基因序列同源性不高，但蛋白結構化學性質上存在很大的保守性，是組成病毒粒子的關鍵部分；E蛋白位于膜蛋白的內部，在病毒粒子包裝時發揮重要作用；S蛋白主要負責與宿主細胞受體相互作用、促進膜融合及誘導中和抗體，由S1、S2兩個亞單位構成；HE蛋白是由兩個單體經二硫鍵連接形成的二聚體，可介導病毒粒子與多種動物的紅細胞凝集。

自從1972年，Mebus等在犢牛的腹瀉病料中檢測出BCV病毒以后，保加利亞、比利時、加拿大、荷蘭、新西蘭、日本、意大利等國也相繼報道了該病毒。目前已遍布全世界，該病給世界各國養牛業造成了巨大的經濟損失。我國最早于1990年姚火春等應用HA/HI方法檢測我國部分地區的牛血清樣本，結果顯示BCV陽性率為44.3～80.2％，之后于1995年楊盛華等從猝死黃牛中分離到BCV病毒，2012年傅彩霞等用ELISA方法檢測來自北京地區密云、昌平和懷柔3個區縣的31個規模化奶牛場的1650份血清，結果顯示大多牛血清樣本存在BCV抗體，平均陽性率達57.2％，表明BCV感染在我國部分牛群中普遍存在。建立牛冠狀病毒快速特異的檢測方法是有效控制和預防該病的關鍵，這樣能夠及早發現并隔離，防止傳染其他健康牛，建立新型、靈敏度高、特異性好的牛冠狀病毒檢測方法迫在眉睫，并且要區分其他病毒細菌等病原也可能引起牛的腹瀉，例如牛輪狀病毒(BRV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBCV)、牛腸道病毒(BEV)、大腸桿菌(E.coli)、沙門氏菌(Salmonella)和金黃色葡糖球菌(S.aureus)。因此，腹瀉的臨床病例需要通過實驗室檢測技術來確定，目前牛冠狀病毒的檢測方法主要包括病原學檢測方法，血清學檢測方法，分子生物學檢測方法等，參見孫留霞,朱平軍,李文華,張素麗,袁文菊.牛冠狀病毒檢測方法的研究進展[J].上海畜牧獸醫通訊,2014(05):20-22.。病原學檢測中的電鏡觀察法檢測病毒結果準確快速，但是高昂的設備及對檢測者的高專業要求限制了該方法的普及應用；病毒的分離與鑒定一般需要較長的周期，且牛冠狀病毒基因組較大，在體外環境中不穩定，初代分離極為困難。血清學檢測方法中的血凝和血凝抑制試驗需要數量充足的新鮮的紅細胞保證試驗的準確；中和試驗需要保證病毒能在某系細胞系增殖并產生細胞病變；酶聯免疫吸附試驗、反向被動血凝試驗、熒光抗體技術及免疫熒光技術等在檢測血清時不能區分犢牛的母源抗體、接種疫苗和野毒感染的結果，如崔鑫.新疆南疆部分規模奶牛場輪狀和冠狀病毒流行病學調查[D].塔里木大學,2019.，]張坤.新疆北疆地區規模化奶牛場犢牛病毒性腹瀉相關病原的調查研究[D].石河子大學,2016.。分子生物學檢測方法主要包括RT-PCR、巢式PCR、雙重PCR及實時熒光定量PCR方法等，但也有其局限性，對復雜體系的擴增會出現非特異性產物擴增以及擴增效率不夠高、檢出限不夠低等問題，實時定量PCR還需要昂貴的儀器，在基層實驗室很難普及推廣。這些缺點限制了上述方法在臨床診斷中的應用。因此，目前亟需建立一種能夠快速、特異的檢測牛冠狀病毒的方法。

發明內容

為了克服現有技術中存在的缺陷和不足，本發明旨在建立一種可克服現有技術不足的牛冠狀病毒BCV的檢測試劑盒及這種試劑盒非疾病診斷的使用方法。