[發(fā)明專利]結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境檢測試劑、試劑盒、裝置及應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010047982.5
• 申請日: 2020-01-16
• 公開（公告）號: CN111235273A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發(fā)明（設計）人: 張恒輝;李亞丹;趙海濤;林健振;錢娟娟
• 申請（專利權(quán)）人: 臻悅生物科技江蘇有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;G01N33/574
• 代理公司: 北京康信知識產(chǎn)權(quán)代理有限責任公司 11240
• 代理人: 路秀麗

本發(fā)明提供了一種結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境檢測試劑、試劑盒、裝置及應用。該檢測試劑包括POLE基因突變檢測試劑以及如下至少一個組合中的至少一個分子標志物的抗體：組合1：CD3、CD8、CD45RO、PD?1及PD?L1；組合2：CD4、FOXP3、CD68、CD163、PD?L1及CD57。利用本申請發(fā)現(xiàn)POLE基因突變與上述部分分子標志物的高表達顯著相關(guān)，確定了POLE基因突變與結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境的關(guān)系，從而便于綜合利用多重免疫組化法同時標記多個分子標志物及在檢測胰腺患者腫瘤微環(huán)境方面檢測靈敏度高，特異性好的優(yōu)勢，相對準確地預測檢測對象是否有較高概率的5年生存率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及多重免疫組化檢測領(lǐng)域，具體而言，涉及一種結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境檢測試劑、試劑盒、裝置及應用。

背景技術(shù)

現(xiàn)有的免疫組化常用二氨基聯(lián)苯胺(即3,3，-diaminobenzidine，DAB)顯色，其原理是因為二氨基聯(lián)苯胺是過氧化物酶的生色底物，在過氧化氫的存在下失去電子而呈現(xiàn)出顏色變化積累，形成棕褐色不溶性產(chǎn)物。DAB主要和蛋白質(zhì)的NH2或SH基團結(jié)合，形成穩(wěn)定的N-N鍵或N-S鍵，然后DAB中的顯色基團就能顯示出顏色，標記到已經(jīng)暴露的蛋白質(zhì)上，從而顯示目標細胞的蛋白質(zhì)分布及種類等。現(xiàn)有技術(shù)在一張切片上一般標記一個分子。

多重免疫組化(mIHC,multiple immnohistochemistry)分析：能在一張組織切片上標記多個免疫細胞及免疫檢查點分子(n≤6，n表示分子標記或抗原標記的數(shù)量)。

第一個分子(抗原)標記：同傳統(tǒng)免疫組織化學基本原理，一抗識別抗原，帶有辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)的二抗結(jié)合一抗，隨后在含有H2O2的反應中，帶有熒光基團的酪胺鹽(Tyramide)，在辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)催化下形成含有共價鍵結(jié)合位點酶促產(chǎn)物，與周圍(包括抗原上、一抗上和二抗上)的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結(jié)合，這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的Tyramide-熒光基團，抗原越多，Tyramide-熒光基團越多，其檢測信號越強。

第n個分子(抗原)標記：在每個抗原標記循環(huán)結(jié)束后，使用微波法去除上一輪的一抗，二抗(由于抗原抗體反應是分子表面的非共價鍵結(jié)合，所形成的復合物并不牢固，可以隨時解離。微波法對標記在抗原上的酪胺鹽熒光信號影響甚小，所以可以在保證上一輪標記信號不丟失的前提下，徹底去除上一輪抗體，而不會對下一輪標記造成干擾。此步驟較易實現(xiàn))。洗脫去除非特異性標記，進行下一輪標記，從而實現(xiàn)多重免疫組化分析。

優(yōu)勢：同一張切片上可以標記多個分子。多個分子標記的過程中，可以用相同種屬來源的不同一抗，以順次單標的方式將帶有不同波長熒光基團的酪胺鹽共價結(jié)合到目標抗原上(對抗原直接進行標記)，隨后通過微波加熱去除抗體(抗體沒了但熒光信號仍留在抗原上)。清除上一輪抗體后即可使用新的抗體繼續(xù)染色，無需擔心交叉反應。

多重免疫組化標記之后，多光譜成像需特定的分析儀器達到多重免疫組化分析的目的。多光譜成像依賴于光譜數(shù)據(jù)采集和光譜拆分計算兩個過程。光譜數(shù)據(jù)采集：多光譜數(shù)據(jù)采集的技術(shù)手段有很多種，比如光柵分光、棱鏡分光、液晶可調(diào)諧濾波器分光等等。運用PerkinElmer公司的Vectra系統(tǒng)(液晶可調(diào)濾波器，LCTF)過濾采集特定波段的光譜信號。LCTF由液晶材料組成，通過調(diào)整附加的電壓改變光線在晶體中的光程，選擇性輸出特定波長的光信號，實現(xiàn)分光的目的。CCD曝光配合LCTF的連續(xù)濾波，就可以準確記錄不同波長段的圖像信號。

光譜拆分：光譜圖像的每個像素點信號都是不同染料和樣本自發(fā)信號的疊加，以每種染料的光譜特征曲線為標準，通過數(shù)學方法對光譜圖像中疊加的信號進行還原運算，從而獲得單通道圖像的過程稱為光譜拆分計算。光譜拆分計算是整個光譜成像不可缺少的重要環(huán)節(jié)，直接影響數(shù)據(jù)結(jié)果的準確性。