[發明專利]一種制備苯丙酮酸的方法

有效

• 申請號: 202010047824.X
• 申請日: 2020-01-16
• 公開（公告）號: CN111118074B
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發明（設計）人: 尹龍飛;付永前;羅希;鄭偉龍;張瑩瑩;尹豐偉
• 申請（專利權）人: 臺州學院
• 主分類號: C12P7/40
• 分類號: C12P7/40;C12N15/70;C12N15/54;C12R1/19
• 代理公司: 北京思創大成知識產權代理有限公司 11614
• 代理人: 尹慧晶

1.一種制備苯丙酮酸的方法，其特征在于，首先將轉氨酶基因ata插入pET28a質粒構建轉氨酶重組大腸桿菌菌體，再進行誘導表達得到表達轉氨酶基因的大腸桿菌菌體，最后將表達轉氨酶基因的大腸桿菌菌體與L-苯丙氨酸進行催化反應得到α-苯丙酮酸；所述表達轉氨酶基因的大腸桿菌菌體的濃度為2.0 g/L，L-苯丙氨酸濃度為6 g/L；其中，催化反應的條件為：pH 為8.0-10，反應時間為2.5-4.0 h，反應溫度為35-42℃；誘導表達的條件為：OD₆₀₀為0.5-0.8，誘導劑濃度為0.1-0.8 mmol/L，誘導時間為6-12 h，誘導溫度為22-30℃；轉氨酶基因ata由Arthrobacter sp.基因組中提取獲得。

2.根據權利要求1所述的制備苯丙酮酸的方法，其特征在于，所述催化反應的過程為：將表達轉氨酶基因的大腸桿菌菌體與L-苯丙氨酸和α-酮戊二酸共同加入PBS緩沖溶液中構成反應液，反應液在搖床中進行催化反應，得到α-苯丙酮酸。

3.根據權利要求2所述的制備苯丙酮酸的方法，其特征在于，α-酮戊二酸濃度為4-8 g/L。

4.根據權利要求3所述的制備苯丙酮酸的方法，其特征在于，α-酮戊二酸濃度為5-7 g/L。

5.根據權利要求1所述的制備苯丙酮酸的方法，其特征在于，所述誘導表達過程為：將轉氨酶重組大腸桿菌菌體在37 ℃進行搖床培養，當菌體OD₆₀₀為0.5-0.8時，加入終濃度為0.1-0.8 mmol/L誘導劑再在22-30℃溫度下誘導反應6-12 h，離心并收集菌體，得到表達轉氨酶基因的大腸桿菌菌體。

6.根據權利要求5所述的制備苯丙酮酸的方法，其特征在于，所述誘導劑為IPTG。

7.根據權利要求5所述的制備苯丙酮酸的方法，其特征在于，所述搖床培養的速率為100-500 rpm/min。

8.根據權利要求1所述的制備苯丙酮酸的方法，其特征在于，所述轉氨酶重組大腸桿菌菌株的構建方法為：先PCR擴增轉氨酶基因得到擴增產物，再用NcoI和XhoI雙酶切PCR擴增產物，并將雙酶切后的產物插入pET28a質粒得到連接有轉氨酶的pET28a質粒，最后將連接有轉氨酶的pET28a質粒轉化BL21感受態細胞，得到轉氨酶重組大腸桿菌菌體。