[發明專利]一種制備苯丙酮酸的方法

有效

• 申請號: 202010047824.X
• 申請日: 2020-01-16
• 公開（公告）號: CN111118074B
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發明（設計）人: 尹龍飛;付永前;羅希;鄭偉龍;張瑩瑩;尹豐偉
• 申請（專利權）人: 臺州學院
• 主分類號: C12P7/40
• 分類號: C12P7/40;C12N15/70;C12N15/54;C12R1/19
• 代理公司: 北京思創大成知識產權代理有限公司 11614
• 代理人: 尹慧晶

本發明公開了一種制備苯丙酮酸的方法，首先將轉氨酶基因ata插入pET28a質粒構建轉氨酶重組大腸桿菌菌體，再進行誘導表達得到表達轉氨酶基因的大腸桿菌菌體，最后將表達轉氨酶基因的大腸桿菌菌體與L?苯丙氨酸進行催化反應得到α?苯丙酮酸；所述表達轉氨酶基因的大腸桿菌菌體的濃度為1.5?2.5g/L，L?苯丙氨酸濃度為4?8g/L。本發明方法采用最優誘導條件結合最優催化條件，避免了pH、溫度、時間、底物濃度和菌體濃度等多方面對苯丙酮酸的產率的影響，底物轉化率達到91％，獲得高質量高產量的苯丙酮酸。

技術領域

本發明涉及生物領域，更具體地，涉及一種制備苯丙酮酸的方法。

背景技術

α-苯丙酮酸(PPA)是雙羰基化合物中的一種，是生產L-苯丙氨酸的前體化合物。在醫學及有機合成領域，苯丙酮酸是非常重要的中間體，此外苯丙酮酸在食品生產和食品添加劑方面也有重要應用。近來，隨著低熱值甜味劑天苯二肽的生產在歐、美、日等國實現了規模化，世界年產量已超過1萬噸，苯丙酮酸作為其限制性生產原料，市場需求逐年遞增，因而刺激了國內外對苯丙酮酸合成工藝的研究，如何大量制備苯丙酮酸成了大家熱衷的話題。目前所用的生產方法包括化學合成法、微生物發酵法、酶轉化法。

化學合成法包括乙內酰脲與苯甲醛合成法、乙酰氨基肉桂酸水解法和海因法等。但化學合成法，反應步驟繁瑣、反應條件較高、產物生成率一般較低、產生的有毒有害產物對環境污染嚴重。微生物發酵法雖具有原料廉價易得、環境污染較小、產物純度高等優點，但其缺點是發酵中產物濃度低，生產周期長，工藝管理要求嚴格，因此也未加入大批量生產PPA的方法行列。

酶轉化法是利用微生物中一些酶的高選擇性的催化特點，對底物進行高效的催化反應，便可以得到更具有價值并且與底物結構相似的產品。酶轉化法的反應類型豐富，流程較簡單，條件較溫和，具有高效性、高選擇性、無毒、環境友好等特點，目前已廣泛用于工業生產當中。然而酶轉化法也受到眾多因素比如pH、抑制劑、溫度、底物濃度等多方面的影響，這些因素對于苯丙酮酸的產率均有較大的影響。

發明內容

本發明的目的是針對上述不足，提出一種制備苯丙酮酸的方法。本發明方法采用最優誘導條件結合最優催化條件，避免了pH、溫度、時間、底物濃度和菌體濃度等多方面對苯丙酮酸的產率的影響，通過轉氨方法獲得苯丙酮酸，底物轉化率達到91％。

本發明的技術方案是：

本發明提供一種制備苯丙酮酸的方法，首先將轉氨酶基因ata插入pET28a質粒構建轉氨酶重組大腸桿菌菌體，再進行誘導表達得到表達轉氨酶基因的大腸桿菌菌體，最后將表達轉氨酶基因的大腸桿菌菌體與L-苯丙氨酸進行催化反應得到α-苯丙酮酸；所述表達轉氨酶基因的大腸桿菌菌體的濃度為1.5-2.5g/L，L-苯丙氨酸濃度為4-8g/L。

優選的，表達轉氨酶基因的大腸桿菌菌體的濃度為1.8-2.2g/L，L-苯丙氨酸濃度為5-7g/L。

最優選的，表達轉氨酶基因的大腸桿菌菌體的濃度為2.0g/L，L-苯丙氨酸濃度為6g/L。

所述催化反應的條件為：pH為8.0-10，反應時間為2.5-4.0h，反應溫度為35-42℃。

優選的，催化反應的條件為：pH為8.0-9.0，反應時間為2.8-3.5h，反應溫度為37-41℃。

最優選的，催化反應的條件為：pH為9.0，反應時間為3h，反應溫度為40℃。

所述誘導表達的條件為：OD₆₀₀為0.5-0.8，誘導劑濃度為0.1-0.8mmol/L，誘導時間為6-12h，誘導溫度為22-30℃。

優選的，誘導表達的條件為：OD₆₀₀為0.7-0.8，誘導劑濃度為0.2-0.4mmol/L，誘導時間為9-11h，誘導溫度為27-29℃。