[發(fā)明專利]一種帶編碼的凝膠微粒及其制備方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010047034.1
• 申請(qǐng)日: 2020-01-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111172257A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-05-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 翟繼先;肖麗丹;莫偉鵬;龍艷萍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南方科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869;C12Q1/6806;B01L3/00
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發(fā)明提供了一種帶編碼的凝膠微粒及其制備方法和應(yīng)用。所述凝膠微粒上連接有至少兩種接頭，所述接頭為核苷酸鏈，包括依次相連的配對(duì)區(qū)、條碼區(qū)和引物區(qū)；所述配對(duì)區(qū)包括Acrydite修飾的測(cè)序引物；所述配對(duì)區(qū)修飾有光敏感基團(tuán)。本發(fā)明提供的帶編碼的凝膠微粒利用微流控技術(shù)和兩輪退火延伸制備得到，合成方法較為簡(jiǎn)單；且所述接頭可以在紫外曝光的條件下脫落，而后作為引物對(duì)細(xì)胞核的開(kāi)放染色質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)接頭上的條碼區(qū)可以作為識(shí)別序列，具有同樣條碼區(qū)的序列來(lái)自于同一細(xì)胞，在進(jìn)行高通量測(cè)序時(shí)，可以通過(guò)條碼區(qū)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分類，將所得結(jié)果歸屬為各個(gè)單細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞ATAC?seq。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于染色質(zhì)開(kāi)放性測(cè)序技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種帶編碼的凝膠微粒及其制備方法和應(yīng)用，尤其涉及一種單細(xì)胞ATAC測(cè)序中使用的帶編碼的凝膠微粒及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

真核生物的細(xì)胞核DNA并不是裸露的，而是與組蛋白結(jié)合形成染色體的基本結(jié)構(gòu)單位核小體，核小體再經(jīng)逐步的壓縮折疊最終形成染色體高級(jí)結(jié)構(gòu)(如人的DNA鏈完整展開(kāi)約2m長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)這樣的折疊就變成了納米級(jí)至微米級(jí)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)而可以儲(chǔ)存在小小的細(xì)胞核)。而DNA的復(fù)制和基因的轉(zhuǎn)錄是需要將DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，從而允許一些調(diào)控因子結(jié)合，這部分打開(kāi)的染色質(zhì)，稱為開(kāi)放染色質(zhì)(Open chromatin)。

二代高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展大大地推動(dòng)了生命科學(xué)研究領(lǐng)域的巨大變革。科學(xué)家們不再局限于研究細(xì)胞的整體表征，更多地從基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀組等多個(gè)方面進(jìn)行單細(xì)胞組學(xué)研究來(lái)揭示單個(gè)細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)狀態(tài)。通過(guò)分析細(xì)胞間的異質(zhì)性來(lái)獲取更多精準(zhǔn)信息，在腫瘤、干細(xì)胞、神經(jīng)、生殖等研究領(lǐng)域具有重要意義。目前，開(kāi)放染色質(zhì)的研究方法包括可接近性染色質(zhì)高通量測(cè)序技術(shù)(Assay for Transposase-AccessibleChromatin with high throughput sequencing，ATAC-seq)以及傳統(tǒng)的DNase-Seq(DNase測(cè)序)及FAIRE-seq(Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory Elements，甲醛輔助分離調(diào)控元件測(cè)序技術(shù))等。

ATAC-seq通過(guò)轉(zhuǎn)座酶對(duì)開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)域進(jìn)行切割建庫(kù)，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)來(lái)分析染色體的可進(jìn)入性(Chromatin Accessibility)，染色質(zhì)的可進(jìn)入性與轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)，常用于表觀遺傳和基因調(diào)控的研究。ATAC-Seq由于所需細(xì)胞量少，可以在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)染色質(zhì)的開(kāi)放狀態(tài)，目前已經(jīng)成為研究染色質(zhì)開(kāi)放性的首選技術(shù)方法。ATAC-seq與其他染色質(zhì)開(kāi)放性檢測(cè)技術(shù)相比，具有操作簡(jiǎn)單、省時(shí)省力、無(wú)需抗體富集和樣本起始量低等顯著優(yōu)勢(shì)。

單細(xì)胞ATAC-seq技術(shù)的發(fā)展將更有效地分析具有高度異質(zhì)性的組織，獲取更精準(zhǔn)的亞細(xì)胞群信息。單細(xì)胞ATAC-seq技術(shù)從數(shù)千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的總體上緊密類似的圖譜獲得來(lái)自數(shù)百個(gè)單細(xì)胞的ATAC-seq圖譜，提供了對(duì)細(xì)胞與細(xì)胞之間異質(zhì)性的了解。單細(xì)胞ATAC-seq將調(diào)控與表型的細(xì)節(jié)連接起來(lái)，為洞察細(xì)胞異質(zhì)性的分子基礎(chǔ)提供了新的視角，該技術(shù)同樣可以檢測(cè)小的或者稀有生物樣本的表觀遺傳學(xué)細(xì)節(jié)，從而在單細(xì)胞水平上檢測(cè)細(xì)胞分化等問(wèn)題。

然而，單細(xì)胞ATAC-seq方法步驟較為復(fù)雜，在具體的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中容易受到實(shí)驗(yàn)室條件的限制，現(xiàn)有技術(shù)中單細(xì)胞測(cè)序時(shí)使用的凝膠微粒制備方法較為復(fù)雜，且制得表面連接有核苷酸的凝膠微粒在使用時(shí)，需要施加化學(xué)刺激如還原劑等使核苷酸從可降解的凝膠微粒表面脫落，然而這種化學(xué)刺激可能會(huì)破壞核苷酸鏈或擴(kuò)增用的酶，使擴(kuò)增無(wú)法正常進(jìn)行。

因此，急需開(kāi)發(fā)一種能夠在不影響擴(kuò)增的情況下實(shí)現(xiàn)表面核苷酸鏈的脫落，還能夠?qū)λ肈NA文庫(kù)進(jìn)行合理有效地編碼，同時(shí)合成方法較為簡(jiǎn)單的凝膠微粒，以滿足單細(xì)胞ATAC技術(shù)的發(fā)展需求。

發(fā)明內(nèi)容