[發(fā)明專利]一種利用貓的腸道菌制造發(fā)酵咖啡的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010046636.5
• 申請(qǐng)日: 2020-01-16
• 公開（公告）號(hào): CN111066930A
• 公開（公告）日: 2020-04-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何方舟;王亮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 肽晟堂生物科技（常州）有限公司
• 主分類號(hào): A23F5/10
• 分類號(hào): A23F5/10;C12N1/00;C12N1/02
• 代理公司: 常州市夏成專利事務(wù)所(普通合伙) 32233
• 代理人: 沈毅

1.一種利用貓的腸道菌制造發(fā)酵咖啡的方法，其特征在于，包括以下的步驟：a，麝香貓腸道菌群的分離與純化培養(yǎng)：

第一步， 10g糞便與100mL無菌水裝入勻漿袋中，使用勻漿機(jī)拍打5min,高速冷凍離心機(jī)離心，去上清，制成勻漿液。

第二步，鑒定：首先配制腸道致病菌鑒定培養(yǎng)基（蛋白胨17.2g，色氨酸 0.9g，Hepes 緩沖液 0.4g，混合色源 6.87g，瓊脂 18g，純凈水 1L，pH 7.3）來鑒定腸道菌群中是否含有致病菌；

第三步，配制培養(yǎng)基：當(dāng)鑒定無致病菌時(shí)，開始配置培養(yǎng)基，分別配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖蛋白胨瓊脂、酵母菌富集培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)乳糖培養(yǎng)基以及Hektoen培養(yǎng)基各約500mL，分裝，121℃滅菌15 min；

第四步，倒平板：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖蛋白胨瓊脂、酵母菌富集培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)乳糖培養(yǎng)基以及Hektoen培養(yǎng)基分別倒30個(gè)平板，做好標(biāo)記；

第五步，制備不同濃度梯度的菌懸液：取10μL的勻漿液，加90uL的無菌水，制成濃度為10-1的溶液。以此類推，配制10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 的菌懸液，在無菌條件下進(jìn)行；

第六步，涂布平板：用移液槍和滅過菌的槍頭，分別向牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖蛋白胨瓊脂、酵母菌富集培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)乳糖培養(yǎng)基以及Hektoen培養(yǎng)基中加100 μL各濃度的各樣的菌懸液，標(biāo)記好濃度，樣品名，均勻涂布，在無菌條件下進(jìn)行；

第七步，恒溫培養(yǎng)：將平板放在24℃條件下恒溫培養(yǎng)24-48h，挑取典型微生物單菌落進(jìn)行劃線純化培養(yǎng)；

第八步，生理生化鑒定：平皿快速檢測(cè)法，利用透明圈法、生長圈法和抑制圈法鑒定，利用菌體在特定固體培養(yǎng)基平板上的生理生化反應(yīng)，將肉眼觀察不到的產(chǎn)量性狀轉(zhuǎn)化成可見的形態(tài)變化；

第九步，咖啡豆培養(yǎng)基進(jìn)一步分離純化：咖啡豆培養(yǎng)基組成：咖啡豆3.4091g/L，Na2HPO4為0.0564g/L，MgSO4為0.1611g/L和酵母粉3.5707g/L，將上述6）中挑取出的菌落在咖啡豆培養(yǎng)基中再進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為20℃，24-48h，將培養(yǎng)后的單菌落按生長速度快慢分別挑取出來；

第十步，分子生物學(xué)鑒定：通過PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得純化菌種的擴(kuò)增DNA并進(jìn)行測(cè)序，數(shù)據(jù)庫序列比對(duì)，對(duì)待分離菌株進(jìn)一步確定，鑒定得出菌種分別為A、B、C和D。

b，發(fā)酵步驟：

第一步，原料篩選：篩選顆粒飽滿、顏色正常的咖啡豆進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)；

第二步，原料烘干：用50℃-70℃對(duì)咖啡豆進(jìn)行熱風(fēng)鼓風(fēng)干燥，使得咖啡豆的濕度保持在50%-60%；

第三步，發(fā)酵：分別對(duì)上述分離出來的各種單菌接種在咖啡豆表面進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定咖啡豆中色氨酸的含量，觀察發(fā)酵結(jié)束咖啡豆咖啡豆用65-70℃對(duì)咖啡豆進(jìn)行熱風(fēng)干燥，使得咖啡豆的濕度保持在55-60%；的顏色并分別對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，通過各個(gè)因素對(duì)咖啡豆的影響進(jìn)行最終菌種的比例調(diào)節(jié)，接種在咖啡豆后，放入培養(yǎng)器，在35-40℃下發(fā)酵20-36小時(shí)；

第四步，烘干：將發(fā)酵結(jié)束的貓屎咖啡放入鼓風(fēng)干燥箱中，在35℃下處理3-6小時(shí)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用貓的腸道菌制造發(fā)酵咖啡的方法，其特征是，所述咖啡豆用65-70℃對(duì)咖啡豆進(jìn)行熱風(fēng)干燥，使得咖啡豆的濕度保持在55-60%。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用貓的腸道菌制造發(fā)酵咖啡的方法，其特征是，所述分別對(duì)分離出來的A、B、C和D比例調(diào)節(jié)進(jìn)行發(fā)酵，比例確定為2：1：2：1，并接種在咖啡豆后，放入培養(yǎng)器，在37℃下發(fā)酵30-36小時(shí)。