[發明專利]三重定量檢測鐮刀菌毒素的熒光微球免疫層析試紙條、其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202010045027.8
• 申請日: 2020-01-16
• 公開（公告）號: CN111089956A
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發明（設計）人: 嚴亞賢;侯思露;孫建和
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N33/558;G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 周一新;胡永宏

1.三重定量檢測鐮刀菌毒素的熒光微球免疫層析試紙條，其特征在于，由下到上依次包括底板、硝酸纖維素膜、結合墊、樣品墊和吸水墊；其中：

所述三重定量檢測的鐮刀菌毒素為伏馬菌素B1(FB1)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)；

所述硝酸纖維素膜按水平方向依次噴涂包被有羊抗鼠IgG抗體作為控制線和ZEN-BSA、DON-BSA和FB1-BSA的各條檢測線；

所述結合墊噴涂有由FB1、DON和ZEN的單克隆抗體-熒光微球標記物按比例混合均勻后的混合物，且噴涂量為2.5～3.5μL/cm。

2.根據權利要求1所述的熒光微球免疫層析試紙條，其特征在于，所述熒光微球的直徑為100nm，其激發波長和發射波長分別為365nm和610nm，紫外燈照射下肉眼觀察其熒光顏色是紅色，其由CdSe/ZnS量子點和生物相容性高分子聚苯乙烯馬來酸酐共聚物通過自組裝制備得到，且所述CdSe/ZnS量子點包裹于所述聚苯乙烯馬來酸酐共聚物內，所述熒光微球表面帶有羧基基團。

3.根據權利要求1所述的熒光微球免疫層析試紙條，其特征在于，所述試紙條的寬度為4mm。

4.權利要求1至3任一項所述熒光微球免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

⑴分別制備FB1、DON和ZEN的單克隆抗體-熒光微球標記物；

⑵預處理樣品墊和結合墊，將步驟⑴中制備的三種單克隆抗體-熒光微球標記物按比例混勻后噴涂于所述結合墊上；

⑶在硝酸纖維素膜上分別噴涂包被ZEN-BSA、DON-BSA、FB1-BSA的檢測線和羊抗鼠IgG抗體的控制線，于37℃真空干燥；

⑷將步驟(3)干燥后的硝酸纖維素膜、步驟(2)制備的結合墊、處理后的樣品墊和吸水墊按順序依次粘貼于所述底板上，組裝后切小條得到。

5.根據權利要求4所述熒光微球免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述FB1、DON和ZEN三種單克隆抗體-熒光微球標記物的制備方法為：

a)分別將0.5～1μgFB1、DON或ZEN的單克隆抗體、10μg熒光微球和0.25μg N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)加入至pH 6的磷酸鹽緩沖鹽溶液中，混勻，于37℃振蕩孵育10～20min；

b)加入10wt.％BSA于上述反應體系中至其終濃度為0.1wt.％，混勻，于37℃振蕩孵育10～20min；

c)12000rpm離心10min，棄上清，沉淀重懸于含0.9wt.％氯化鈉、1wt.％BSA和0.09wt.％疊氮鈉的儲存液中，超聲20s，于4℃保存。

6.根據權利要求4所述熒光微球免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述結合墊的預處理方法為：將結合墊于含質量濃度分別為6％海藻糖、1％BSA、0.5％PvPk30、0.5％Tween20和0.5％Tetronic1307的10mM pH7.4的PBS緩沖液中浸泡30min，取出，60℃真空干燥2h；

所述樣品墊的預處理方法為：將樣品墊于含質量濃度分別為6％海藻糖、1％BSA、0.05％Tetronic1307、0.5％PvP k30、0.5％Tween20和0.05％疊氮鈉的10mM pH7.4的PBS緩沖液中浸泡30min，取出，60℃真空干燥2h。

7.根據權利要求4所述熒光微球免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述FB1-BSA、DON-BSA、ZEN-BSA和羊抗鼠IgG抗體的濃度均為50～500μg/mL，噴涂量為0.8μL/cm。