[發(fā)明專利]蛋白質(zhì)標(biāo)記用化合物、蛋白質(zhì)標(biāo)記用試劑盒以及蛋白質(zhì)定點標(biāo)記方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010044197.4
• 申請日: 2020-01-15
• 公開（公告）號: CN113121384B
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊志偉;劉錚
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州易萊生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C07C247/04
• 分類號: C07C247/04;C07K1/13;G01N21/64;G01N33/58;G01N33/68
• 代理公司: 北京萬景律師事務(wù)所 11993
• 代理人: 張士茜

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于標(biāo)記蛋白質(zhì)的化合物。該化合物的合成步驟簡單、原料簡單易得，與還原蛋白質(zhì)的巰基發(fā)生親和反應(yīng)的活性極高，能夠有效地對蛋白質(zhì)進行標(biāo)記。本發(fā)明進一步涉及包含該化合物的蛋白質(zhì)標(biāo)記用試劑盒，以及使用該化合物進行蛋白質(zhì)標(biāo)記的方法。該方法快速高效，使得可以對同一個蛋白實行高通量的標(biāo)記物的篩選。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于標(biāo)記蛋白質(zhì)的化合物，進一步涉及包含該化合物的蛋白質(zhì)標(biāo)記用試劑盒，以及使用該化合物進行蛋白質(zhì)標(biāo)記的方法。

背景技術(shù)

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能對生命體有著十分重要的意義。研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)以及生物拓撲學(xué)的手段包括熒光光譜、核磁共振、電子顯微鏡、X射線晶體衍射等。這些研究通常需要使用能夠共價結(jié)合至感興趣蛋白的分子標(biāo)記，從而輔助檢測或者純化標(biāo)記后的蛋白及其結(jié)合對象。可用于標(biāo)記的標(biāo)記物包括生物素、酶、熒光基團和放射性同位素等，其中最常用的是熒光基團或化學(xué)發(fā)光基團，通過對其發(fā)光特性的觀察來研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)運動和功能等特征。

蛋白質(zhì)標(biāo)記的常用位點之一是半胱氨酸殘基中的巰基(-SH)。現(xiàn)有技術(shù)中公開的標(biāo)記物與蛋白質(zhì)的連接方式包括以下幾種：(1)通過二硫鍵連接，(2)烷基鹵化物或缺電子烯烴烷基化形成的硫醚鍵，(3)非天然氨基酸的插入和點擊化學(xué)相結(jié)合。L.Zhang等通過不飽和烷基鹵化物將高分子標(biāo)記到抗體上(Biomaterials?64(2015)2-9)，標(biāo)記過程涉及原位ATRP活性聚合以形成連接標(biāo)記物的寡聚物鏈段，原料成本和工藝要求均較高，不適宜產(chǎn)業(yè)規(guī)模的應(yīng)用。Graham等通過點擊化學(xué)的方法將DOTA衍生物定點標(biāo)記到蛋白質(zhì)上(InorganicChem.2016,55,1674-1682)，通過將原有的Q80位置的氨基酸殘基替換為非天然氨基酸4-疊氮基-L-苯丙氨酸(AzF)或4-疊氮甲基-L-苯丙氨酸(AzMF)，從而在蛋白質(zhì)中引入疊氮基團，并隨后在Cu(I)催化的條件下，將含有炔基的鋱化合物標(biāo)記物連接到蛋白質(zhì)上。該標(biāo)記方法的缺點在于，插入非天然氨基酸成本極高，難以開展商業(yè)應(yīng)用。

點擊化學(xué)是一種通過小單元的拼接來快速可靠地完成形形色色分子的化學(xué)合成的化學(xué)反應(yīng)方法。目前應(yīng)用最多的點擊化學(xué)方法涉及疊氮基與炔基在催化劑存在下的加成反應(yīng)。現(xiàn)有技術(shù)中公開了通過點擊化學(xué)反應(yīng)將放射性同位素標(biāo)記于分子之上的方法(US2006/0263293A1)，以及識別候選影像探針(candidate?imaging?probe)的方法，但這些方法僅對特定的底物有效，應(yīng)用范圍有限。

1,2-二離去基團化合物是一類簡單反應(yīng)活性高、簡單易得的化合物，這類化合物可以和二巰基化合物發(fā)生親電反應(yīng)形成穩(wěn)定的環(huán)狀化合物。但是，將1,2-二離去基團化合物應(yīng)用于蛋白質(zhì)標(biāo)記時，其技術(shù)壁壘包括此類化合物的親核反應(yīng)活性較高，容易和標(biāo)記物分子的熒光基團或者發(fā)光基團發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致標(biāo)記物穩(wěn)定性降低和顯現(xiàn)性削弱，最終影響了蛋白質(zhì)的標(biāo)記效果。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的一個目的在于提供一種適合于蛋白質(zhì)標(biāo)記的化合物，該化合物能夠與蛋白質(zhì)有效地結(jié)合，并且為標(biāo)記物分子提供連接位點，并提高標(biāo)記物分子的穩(wěn)定性，且不涉及諸如蛋白質(zhì)的氨基酸殘基替換或者活性聚合等復(fù)雜、昂貴的反應(yīng)步驟，能夠最終實現(xiàn)成本低廉、高效快捷的蛋白質(zhì)標(biāo)記。

具體而言，本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)標(biāo)記用化合物具有式I所示結(jié)構(gòu)：

其中，

M1和M2相同或者不同，選自離去基團，優(yōu)選Cl、Br、I、對甲苯磺酰基(OTs)、甲基磺酰基(OMs)、三氟甲磺酰基(OTf)中的一種，進一步優(yōu)選鹵素，更進一步優(yōu)選Br；更優(yōu)選地，M1和M2相同，

N選自疊氮基或炔基，

X選自NH或O，

Y為二價基團，q為0或1，

L為二價聚合物鏈段，p為0或1。