[發(fā)明專利]副溶血弧菌的快速恒溫檢測方法、引物組及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010042450.2
• 申請日: 2016-08-30
• 公開（公告）號: CN111057781B
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹永梅;李園園;李雪玲;韋朝春;賈犇;劉偉;陸長德;李亦學(xué)
• 申請（專利權(quán)）人: 上海旺旺食品集團(tuán)有限公司;上海產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/63
• 代理公司: 上海麥其知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

本發(fā)明公開了一種針對副溶血弧菌的快速恒溫檢測方法、引物組及應(yīng)用。所述方法為：從待測樣品中提取基因組DNA；以所述基因組DNA為模板，以能擴(kuò)增副溶血弧菌特異性序列的引物組為引物，在酶反應(yīng)體系下進(jìn)行恒溫擴(kuò)增反應(yīng)；通過判斷反應(yīng)結(jié)果是否為陽性，確定待測樣品中是否存在副溶血弧菌。本發(fā)明檢測方法具有高靈敏度和高特異性，檢測時間短，結(jié)果判定簡單，操作便捷，成本低，具廣泛應(yīng)用前景。

本申請是2016年8月30日提交的、申請?zhí)枮?01610780447.4、發(fā)明名稱為：“快速恒溫檢測副溶血弧菌的方法、引物及應(yīng)用”的中國發(fā)明專利申請的分案申請；該母案申請要求申請日為2015年9月2日、申請?zhí)枮?01510556917.4、發(fā)明名稱為“快速恒溫檢測阪崎克羅諾桿菌的方法、引物及試劑盒”的中國發(fā)明專利申請的優(yōu)先權(quán)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速恒溫檢測副溶血弧菌的方法、引物及試劑盒。

背景技術(shù)

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽細(xì)菌，廣泛分布于江河、海洋及熱帶和溫帶沿海地區(qū)，主要寄生于浮游生物、魚、蝦蟹、貝類等水產(chǎn)品中，直接或間接食用被該菌污染的食品會引發(fā)腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐、發(fā)燒等典型胃腸炎反應(yīng)，嚴(yán)重者可引起敗血癥。副溶血弧菌發(fā)病呈世界性分布，尤其在沿海地區(qū)發(fā)病率較高，在我國沿海城市副溶血性弧菌引起的食物中毒在細(xì)菌性食物中毒事件中所占比例已經(jīng)超過沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌等，位居首位。因此，對于該菌的檢測和預(yù)防都具有重要意義。

目前，國內(nèi)外針對副溶血弧菌的檢測方法仍以常規(guī)培養(yǎng)方法作為標(biāo)準(zhǔn)，其檢測周期較長(達(dá)5-7天)，操作相對復(fù)雜，檢測效率較低，難以滿足現(xiàn)代社會對于食源性致病菌檢測過程高通量、高靈敏度、高特異性、快速、便捷的要求。近年來隨著核酸分子檢測技術(shù)的發(fā)展，以特異性基因為靶標(biāo)建立的PCR技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于副溶血弧菌的檢測，具有靈敏度高，檢測時間短等優(yōu)點，但該方法必須配備專門的儀器設(shè)備，并且需要專業(yè)的操作人員。因此，并不適合廣泛應(yīng)用于基層檢測部門尤其是企業(yè)生產(chǎn)線內(nèi)部進(jìn)行的實時實地檢測。為確保食品安全，急需快速、簡單、準(zhǔn)確的方法來檢測食品中的副溶血性弧菌。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年來發(fā)展起來的一種新型恒溫核酸擴(kuò)增方法，該法針對靶序列的6個區(qū)域設(shè)計4條特異性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游內(nèi)引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2組成，BIP由B1C和B2組成)，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件保溫約60min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生肉眼可見的反應(yīng)副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀(見文獻(xiàn)Notomi T,OkayamaH,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermalamplification of DNA,Nucleic Acids Research,2000 Jun 15；28(12):E63)。該技術(shù)具有不需要PCR儀或熒光定量PCR儀、恒溫下即可完成，肉眼即可判斷反應(yīng)結(jié)果，以及靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時間短、操作便捷、成本低等優(yōu)點。