[發明專利]創傷弧菌的核酸快速恒溫檢測方法及應用

有效

• 申請號: 202010042443.2
• 申請日: 2016-08-30
• 公開（公告）號: CN111057778B
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發明（設計）人: 曹永梅;李雪玲;李園園;韋朝春;劉偉;賈犇;陸長德;李亦學
• 申請（專利權）人: 上海旺旺食品集團有限公司;上海產業技術研究院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/63
• 代理公司: 上海麥其知識產權代理事務所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

本發明公開了一種針對創傷弧菌的快速恒溫檢測方法、引物組及試劑盒。所述方法為：從待測樣品中提取基因組DNA；以所述基因組DNA為模板，以能擴增創傷弧菌特異性序列的引物組為引物，在酶反應體系下進行恒溫擴增反應；通過判斷反應結果是否為陽性，確定待測樣品中是否存在創傷弧菌。本發明檢測方法具有高靈敏度和高特異性，檢測時間短，結果判定簡單，操作便捷，成本低，具廣泛應用前景。

本申請是2016年8月30日提交的、申請號為201610767402.3、發明名稱為：“快速恒溫檢測創傷弧菌的方法、引物及試劑盒和應用”的中國發明專利申請的分案申請；該母案申請要求申請日為2015年9月2日、申請號為201510556917.4、發明名稱為“快速恒溫檢測阪崎克羅諾桿菌的方法、引物及試劑盒”的中國發明專利申請的優先權。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種快速恒溫檢測創傷弧菌的方法、引物及試劑盒。

背景技術

創傷弧菌(Vibrio vulnificus)，又稱海洋弧菌，是在海水和一些海洋食品中發現的一種嗜鹽性革蘭氏陰性致病菌。人類通常是因為生食受污染的海產品，或者傷口接觸受污染的海水或海洋動物而感染該細菌，可引起原發性敗血癥、創傷感染和急性胃腸炎等癥狀，其中引起的敗血癥性休克的死亡率高達50％以上。在我國，創傷弧菌感染多發生于沿海地區，被列為食品污染源中八大高危微生物之一。此外，由創傷弧菌引起的最初癥狀并無明顯特異性，因此對該菌的預防和檢測尤為重要。

目前，針對創傷弧菌的檢測主要通過病原分離與生化鑒定完成，但存在檢測周期長，操作繁瑣，不易鑒別相近物種等缺點。近年來隨著核酸分子檢測技術的發展，以特異性基因為靶標建立的常規PCR或real-time PCR技術已成功應用于創傷弧菌的實驗室診斷，具有靈敏度高，檢測時間短等優點，但該方法必須配備昂貴的儀器設備，需專門的操作人員。因此，并不適合廣泛應用于基層檢測部門尤其是企業生產線內部進行的實時實地檢測。為確保食品安全，急需快速、簡單、準確的方法來檢測食品中的創傷弧菌。

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年來發展起來的一種新型恒溫核酸擴增方法，該法針對靶序列的6個區域設計4條特異性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游內引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2組成，BIP由B1C和B2組成)，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件保溫約60min，即可完成核酸擴增反應，產生肉眼可見的反應副產物-白色焦磷酸鎂沉淀(見文獻Notomi T,OkayamaH,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermalamplification of DNA,Nucleic Acids Research,2000Jun 15；28(12):E63)。該技術具有不需要PCR儀或熒光定量PCR儀、恒溫下即可完成，肉眼即可判斷反應結果，以及靈敏度高、特異性強、反應時間短、操作便捷、成本低等優點。