[發明專利]創傷弧菌的核酸快速恒溫檢測方法及應用

有效

• 申請號: 202010042443.2
• 申請日: 2016-08-30
• 公開（公告）號: CN111057778B
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發明（設計）人: 曹永梅;李雪玲;李園園;韋朝春;劉偉;賈犇;陸長德;李亦學
• 申請（專利權）人: 上海旺旺食品集團有限公司;上海產業技術研究院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/63
• 代理公司: 上海麥其知識產權代理事務所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

1.一種非診斷性目的的針對創傷弧菌的恒溫檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）從待測樣品中提取基因組DNA；

（2）以所述基因組DNA為模板，以能擴增創傷弧菌基因組特異性堿基序列的引物組作為引物，在酶反應體系下進行恒溫擴增反應；

（3）通過判斷反應結果是否為陽性，確定待測樣品中是否存在創傷弧菌；

其中，所述創傷弧菌基因組特異性堿基序列為GI號為320154846的創傷弧菌基因組的112393～113296 bp位序列；

其中，所述能擴增創傷弧菌基因組特異性堿基序列的引物組選自引物組D；

引物組D：

上游外引物F3_D：5’-CAAGTGGAAGTGTATCACC-3’（SEQ ID NO：13）；

下游外引物B3_D：5’-GGAATAATGTACGACTCCTG-3’（SEQ ID NO：14）；

上游內引物FIP_D：5’-ATGCTTGTCGTCTTTCACCGCTCTAAAGATGAGATGATCGC-3’（SEQ IDNO：15）；

下游內引物BIP_D：5’-GTTGCCTCGAAATGCATTAACTCTCTTGCGGATGAATGATT-3’（SEQ IDNO：16）。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2）中，所述酶反應體系包括：1× BstDNA聚合酶反應緩沖液，2-9mmol/L Mg²⁺，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的如權利要求1中所述的FIP_D和BIP_D引物，0.15-0.3μmol/L的如權利要求1中所述的F3_D和B3_D引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶，0-1.5mol/L的甜菜堿。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述恒溫擴增反應的反應程序為：① 60～65℃孵育10～90min；② 80℃終止反應2～20min。

4.用于針對創傷弧菌的恒溫檢測的引物，其特征在于，所述引物包括能擴增創傷弧菌基因組特異性堿基序列的引物組，其序列為GI號為320154846的創傷弧菌基因組的112393～113296 bp位的核酸序列的一部分或其互補鏈的一部分；

其中，所述能擴增創傷弧菌基因組特異性堿基序列的引物組選自引物組D；

引物組D：

上游外引物F3_D：5’-CAAGTGGAAGTGTATCACC-3’（SEQ ID NO：13）；

下游外引物B3_D：5’-GGAATAATGTACGACTCCTG-3’（SEQ ID NO：14）；

上游內引物FIP_D：5’-ATGCTTGTCGTCTTTCACCGCTCTAAAGATGAGATGATCGC-3’（SEQ IDNO：15）；

下游內引物BIP_D：5’-GTTGCCTCGAAATGCATTAACTCTCTTGCGGATGAATGATT-3’（SEQ IDNO：16）。

5.一種針對創傷弧菌的恒溫檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如權利要求4所述的引物。

6.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，其還包括Bst DNA聚合酶反應緩沖液、BstDNA聚合酶、dNTP 溶液、Mg²⁺、甜菜堿中的一種或多種。

7.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的酶反應體系包括：1× BstDNA聚合酶反應緩沖液，2-9mmol/L Mg²⁺，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP_D和BIP_D引物，0.15-0.3μmol/L的F3_D和B3_D引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶，和0-1.5mol/L的甜菜堿。

8.引物在非診斷目的的恒溫檢測創傷弧菌中的應用，其特征在于，所述引物為如權利要求 4所述的引物。

9.如權利要求5~7之任一項所述的試劑盒在非診斷目的的恒溫檢測創傷弧菌中的應用。