[發明專利]一種冬生疫霉的特異性檢測新靶標Phibe_s00003g00002.1及其應用

有效

• 申請號: 202010041623.9
• 申請日: 2020-01-15
• 公開（公告）號: CN111118038B
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 戴婷婷;胡濤;汪澳華;焦彬彬;嚴娟;廖婷婷;陳貞鵬
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C07K14/37;C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 王佳妹

本發明公開了一種冬生疫霉的檢測新靶標Phibe_s00003g00002.1及其專用檢測引物和檢測方法，該檢測靶標Phibe_s00003g00002.1的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。同時，公開了特異性檢測靶標Phibe_s00003g00002.1的RPA檢測技術的特異性引物及探針組合，其正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物序列如SEQ ID NO：4所示，探針序列如SEQ ID NO：5所示。本發明發現了新的檢測靶標，且基于該靶標的快速檢測方法準確性高、特異性強、操作方便、實用性好、實現了恒溫擴增，同時本發明設計的引物及探針組合用于RPA?LFD檢測技術，其特異性強，靈敏度高，為冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)的檢測提供了新的技術平臺。

技術領域

本發明屬于基因檢測技術領域，具體涉及一種冬生疫霉的特異性新檢測靶標Phibe_s00003g00002.1及其應用。

背景技術

疫霉(Phytophthora)，任何植物一旦被它侵染就會在劫難逃，損傷嚴重。所以，拉丁文Phytophthora被描述為：植物的毀壞者。Phyto，在原來的希臘語中是植物的意思，phthora則是破壞的意思。疫霉(Phytophthora)正式報道有100多個種,許多疫霉都有嚴重危害農業生產安全的記錄，可以說個個是農作物的毀壞者，輕則造成缺苗斷壟，重則造成嚴重的產量損失，甚至絕產。因此，防止外來有害檢疫性疫霉菌傳入我國具有重要意義。我國進境檢疫性名錄中包括冬生疫霉Phytophthora hibernalis、丁香疫霉P.syringae、櫟樹猝死病菌P.ramorum、大豆疫霉病菌P.sojae、栗疫霉黑水病菌P.cambivora、馬鈴薯疫霉緋腐病菌P.erythroseptica、草莓疫霉紅心病菌P.fragariae、樹莓疫霉根腐病菌P.rubi、雪松疫霉根腐病菌P.lateralis、苜蓿疫霉根腐病菌P.medicaginis、菜豆疫霉病菌P.phaseoli共11種疫霉菌。柑橘是一種性喜溫暖濕潤氣候的經濟型水果，在全世界138個國家(地區)有種植，產量和面積均占百果之首^[1]。我國是柑橘生產大國，柑橘產業在我國農業經濟發展中占有重要地位，從2007年起，我國已經成為全球柑橘年產量最大的國家。1925年，首次在澳大利亞西部柑橘果實上發現冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)。目前冬生疫霉主要寄主為柑橘、蘋果、番茄等植物，可引發水果褐腐病、枝枯病和葉枯病，導致果實變褐、腐爛、直至植株死亡。該病菌首次在澳大利亞西部的柑桔果實上發現，目前在歐洲的絕大部分國家，以色列、土耳其、美國加州、澳大利亞、新西蘭、巴西等國家和地區均有分布，尤其以意大利、葡萄牙等國柑橘受害嚴重。2015年，上海口岸從進口美國臍橙和柚子中，截獲冬生疫霉。目前中國尚未有冬生疫霉(P.hibernalis)分布的報道。傳統的冬生疫霉菌的分類鑒定主要是基于形態學特征、致病性測定、生理生化特征等。傳統的分離疫霉菌的方法采用誘捕法從土壤、灌溉水和植物材料中分離疫霉菌。為了提高誘捕效果，可在土壤溶液中加入少量抗生素和殺菌劑抑制雜菌生長。適用于做誘餌的植物材料因不同疫霉菌也有所不同，松針適合用于誘捕冬生疫霉菌。傳統方法在冬生疫霉菌檢測中發揮了重要作用，但是費時費力而且要求操作者具備專業的疫霉菌分離、形態學鑒定知識和豐富的經驗；同時傳統分類鑒定方法耗時長、靈敏度低、易受人為及環境等諸多因素的干擾，不能在病害潛伏期和發病初期做出診斷，很難對病害發生進行及時的監測和有效控制。隨著分子生物學的發展，PCR技術為植物病原診斷提供了快速、靈敏、準確的優勢，在病原物的鑒定和檢測中的地位越來越重要。近年來，一些疫霉菌的PCR檢測方法被開發出來。這些方法中設計的引物的來源主要都是轉錄間隔區(ITS)或者elicitin基因。這些區域或者基因在基因組中都是高拷貝的，所以很容易被檢測到。但是越來越多的研究發現，部分疫霉種的ITS序列差異很小，以此為靶標設計的引物難以將不同種區分開來。