[發明專利]食源性致病菌高通量SERS檢測方法

在審

• 申請號: 202010041058.6
• 申請日: 2020-01-15
• 公開（公告）號: CN111398241A
• 公開（公告）日: 2020-07-10
• 發明（設計）人: 白向茹;王利華;肖康飛;韓艷云
• 申請（專利權）人: 武漢市農業科學院
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65
• 代理公司: 武漢河山金堂專利事務所(普通合伙) 42212
• 代理人: 胡清堂

本發明涉及食源性致病菌檢測技術領域，提供了食源性致病菌高通量SERS檢測方法，包括以下步驟：靜默區功能檢測探針的制備、捕獲探針的制備、兩種食源性致病菌高通量檢測標準工作曲線的建立、水質中兩種食源性致病菌含量的同時SERS測定。本發明提供的高通量表面增強拉曼光譜(Surface?enhanced Raman scattering,SERS)檢測方法能特異、靈敏和快速地同時檢測兩種食源性致病菌的含量。

技術領域

本發明屬于食源性致病菌檢測技術領域，具體涉及食源性致病菌高通量SERS檢測方法。

背景技術

食源性疾病不僅嚴重影響人們的生命健康，而且影響全球經濟的發展。據美國疾病控制與預防中心(CDC)估計，每年約有六分之一的美國人因食用被污染的食物或水源而患病，且其中有3000人因此而死亡，至此造成的經濟損失高達156億美元。同時，世界衛生組織統計數據表明，每年在美國約有100萬人口遭受食源性疾病的侵害。作為引發食源性疾病的頭號元兇，食源性致病菌是存在于食物中能引發疾病反應的病原微生物，常見的食源性致病菌有致病性大腸埃希菌、沙門氏菌、志賀氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌七種。

目前，可用于檢測食源性致病菌的方法主要有傳統法以及新的擴增技術。傳統的細菌檢測包括染色、光學顯微鏡檢查、微生物培養等，然而其只能判別出Gram+(G+)和Gram-(G-)，并且微生物培養過程需要24-72小時，這對貨架壽命較短的食品在產品衛生狀況方面的評估作用不大，難以滿足食品生產廠家特別是出口廠家的檢測期較短的需求；新的擴增技術，包括免疫測定(酶聯免疫吸附法(ELISA))、核酸鑒定(聚合酶鏈式反應(PCR))等，都需要繁瑣的操作過程，且ELISA的檢測結果易受多種因素影響，易出現假陽性，不適于現場檢測；高通量測序和微陣列可以同時檢測多種病原菌，但這些技術需要事先分離出細菌的DNA，除了需要專業的操作人員外，且需要昂貴的核酸擴增儀器，均難以滿足當前致病菌現場快速檢測的迫切需求。因此，要快速、準確地判斷食品或水源中的多種主要致病菌或對多個樣本進行同時檢測，急需一種能同時高通量、無干擾且快速準確地檢測多種食源性致病菌的方法，實現有效預防和控制食源性疾病的暴發，減輕致病菌對人類造成的危害。

表面增強拉曼散射(Surface enhanced Raman scattering，SERS)技術，其譜峰窄、檢測時間短(通常零點幾秒至幾十秒即可完成檢測)、特異性好(譜峰直接反應分子的振動轉動信息，是一種指紋光譜)、靈敏度非常高(目前可以實現單分子檢測)，非常適合復雜樣本的快速高靈敏檢測。目前國內外SERS檢測食源性致病菌的方法歸納起來有兩種，分為無標記檢測和標記檢測。無標記檢測食源性致病菌，一般是采用納米金屬溶膠或固體基底，利用致病菌本身的拉曼信號對其進行直接檢測，該種檢測方式簡單，但是重現性較差，且需要運用化學計量學分析(主成分分析和層析聚類分析等)對采集到的光譜信號進行區分，不適合現場快速檢測；SERS標記檢測一般采用指紋區拉曼信號作為信號分子，將其修飾在增強基底表面，通過連接特異性抗體實現致病菌的識別。然而，該種方法很難用于多種致病菌的高通量檢測，主要原因如下：(1)多個指紋區拉曼信號分子，相互之間拉曼峰更容易發生重疊；(2)生物體系中其他共存物在指紋區的拉曼信號容易與所選定的指紋區拉曼信號分子信號發生重疊。基于此，大大加大了譜圖的辨識困難性，嚴重影響檢測結果的準確性。

發明內容

針對這種情況，本發明提供了食源性致病菌高通量SERS檢測方法，使用表面增強拉曼光譜法(Surface-enhanced Raman scattering,SERS)高通量測定致病菌含量，可有效解決現有技術存在的問題。

為實現上述目的，本發明提供的技術方案如下：食源性致病菌高通量SERS檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)靜默區功能性檢測探針的制備