[發(fā)明專(zhuān)利]唐古特虎耳草中天然自由基清除劑的分離工藝及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010041021.3
• 申請(qǐng)日: 2020-01-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111187159B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黨軍;陶燕鐸;王啟蘭;邵赟
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C07C51/47
• 分類(lèi)號(hào): C07C51/47;C07C65/03;C07C67/56;C07C69/84;C07H15/203;C07H1/08;A61K31/192;A61K31/235;A61K31/7034;A61P39/06;A23L33/105
• 代理公司: 成都華風(fēng)專(zhuān)利事務(wù)所(普通合伙) 51223
• 代理人: 杜朗宇

1.唐古特虎耳草中天然自由基清除劑的分離工藝，其特征在于：該工藝具體包括如下步驟：

步驟1，提取：將唐古特虎耳草全草陰干，粗碎后按料液比1g：5～100mL的甲醇提取，在室溫下提取2～4次，每次2～4h，過(guò)濾、合并濾液，即濾液A，該濾液A按聚酰胺的量：唐古特虎耳草藥材的量＝1:5拌樣并減壓干燥，即得唐古特虎耳草提取物拌樣樣品；

步驟2，微孔樹(shù)脂柱粗分：唐古特虎耳草提取物拌樣樣品，該樣品經(jīng)裝有微孔樹(shù)脂的中壓色譜塔分離，經(jīng)檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm的紫外檢測(cè)器檢測(cè)，收集制備色譜圖中第一個(gè)主要的色譜峰餾分，該餾分經(jīng)減壓干燥即得目標(biāo)組分；

步驟3，在線(xiàn)自由基清除劑組分篩選：在所述唐古特虎耳草含有目標(biāo)成分的組分中加入其質(zhì)量5～10倍的體積濃度為70～90％的甲醇進(jìn)行溶解，配制樣品濃度為50.0～100.0mg/mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，得到唐古特虎耳草甲醇樣品溶液，即濾液B，取1mL濾液B，利用在線(xiàn)HPLC-DPPH色譜聯(lián)用系統(tǒng)篩選唐古特虎耳草含有目標(biāo)成分的組分中自由基清除劑；

步驟4，反相制備柱制備：所述濾液B經(jīng)反相色譜柱分離，經(jīng)檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm的紫外檢測(cè)器檢測(cè)，收集制備色譜圖中對(duì)應(yīng)的色譜峰餾分Fr1-1、Fr1-2、Fr1-3和Fr1-4，色譜峰餾分Fr1-1和Fr1-3經(jīng)減壓干燥分別得到含有目標(biāo)化合物1、2、4和5的組分Fr1-1和Fr1-3，色譜峰餾分Fr1-2和Fr1-4經(jīng)減壓干燥得到純度大于95％的自由基清除劑Protocatechuic acid，標(biāo)記為3號(hào)和自由基清除劑3-O-galloyl-shikimic acid，標(biāo)記為6號(hào)；

步驟5，F(xiàn)r1-1的反相制備液相色譜純化：含有目標(biāo)化合物1和2的組分用體積分?jǐn)?shù)為0～10％的甲醇-水溶液溶解，配制樣品濃度為20.0～50.0mg/mL，均經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，得到濾液，即濾液C，濾液C經(jīng)反相液相制備色譜純化，經(jīng)檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm的紫外檢測(cè)器檢測(cè)，收集濾液C制備色譜圖中主要的色譜峰餾分，該色譜峰餾分經(jīng)減壓干燥即得純度大于95％的自由基清除劑Gallicacid，標(biāo)記為1號(hào)和自由基清除劑Gallate-3-O-β-D-glucopyranoside，標(biāo)記為2號(hào)；

步驟6，F(xiàn)r1-3的親水/反相二維液相色譜純化：含有目標(biāo)化合物4和5的組分Fr1-3用體積分?jǐn)?shù)為50～100％的甲醇-水溶液溶解，配制樣品濃度為20.0～50.0mg/mL，均經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，得到濾液，即濾液D，濾液D經(jīng)親水/反相二維液相色譜純化，經(jīng)檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm的紫外檢測(cè)器檢測(cè)，收集濾液D反相制備色譜圖中前兩個(gè)主要的色譜峰餾分，該色譜峰餾分經(jīng)減壓干燥即得純度大于95％的自由基清除劑4-O-galloyl-(-)-shikimic acid，標(biāo)記為4號(hào)和自由基清除劑5-O-galloyl-(-)-shikimic aicd，標(biāo)記為5號(hào)；

其中，所述1-6號(hào)自由基清除劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式依次為：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的唐古特虎耳草中天然自由基清除劑的分離工藝，其特征在于：所述步驟3中，在線(xiàn)HPLC-DPPH色譜聯(lián)用系統(tǒng)，第一臺(tái)高效液相色譜儀采用耐純水C18柱250×4.6mm，5μm親水色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm；第二臺(tái)高效液相色譜儀進(jìn)甲醇溶解的DPPH溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)為517nm。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的唐古特虎耳草中天然自由基清除劑的分離工藝，其特征在于：所述步驟1、步驟2、步驟4、步驟5和步驟6中，減壓干燥的條件均為：真空度50～250mbar，溫度40～60℃。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的唐古特虎耳草中天然自由基清除劑的分離工藝，其特征在于：所述步驟2中，微孔樹(shù)脂柱分離的工作參數(shù)為色譜柱柱長(zhǎng)460mm、直徑49mm，微孔樹(shù)脂柱固定相為HP20SS或CHP20P，流動(dòng)相A為水，B為乙醇，色譜條件為0～120min，0～100％B，120～150min，100％B，進(jìn)樣量為40g，流速為30mL/min。