[發明專利]一種產1,4-丁二醇的重組丁醇梭菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 202010040929.2
• 申請日: 2020-01-15
• 公開（公告）號: CN111088209B
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發明（設計）人: 應漢杰;柳東;李楠;王振宇;葛世凱;曹幸園;牛歡青;陳勇
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/60;C12N15/74;C12P7/18;C12R1/145
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 胡建華

1.一種產1,4-丁二醇的重組丁醇梭菌，其特征在于，所述的重組丁醇梭菌是通過在丁醇梭菌中表達4-羥基丁酰輔酶A脫水酶構建得到的；

其中，所述的丁醇梭菌為ATCC824；

其中，所述的表達4-羥基丁酰輔酶A脫水酶是通過cbei_2100，ckl_3020，abfD，lf65-02412和ctk-c07640中的任意一種的基因片段表達；其中，所述cbei_2100，ckl_3020，abfD，lf65-02412和ctk-c07640基因片段的核苷酸序列分別為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。

2.權利要求1所述的產1,4-丁二醇的重組丁醇梭菌的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）將cbei_2100，ckl_3020，abfD，lf65-02412和ctk-c07640中的任意一種的基因片段插入到載體質粒的酶切位點后，得到重組質粒；

（2）將步驟（1）得到的重組質粒進行甲基化，得到甲基化的重組質粒；

（3）將步驟（2）得到的甲基化的重組質粒轉至丙酮丁醇梭菌中，篩選即得。

3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，步驟（1）中，所述的載體質粒為PSY8，其核苷酸序列如 SEQ ID NO.7所示。

4.根據權利要求1所述的產1,4-丁二醇的重組丁醇梭菌，其特征在于，所述的重組丁醇梭菌中etfA基因失活，所得重組丁醇梭菌中etfA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

5.權利要求4所述的產1,4-丁二醇的重組丁醇梭菌的構建方法，其特征在于，etfA基因失活的重組丁醇梭菌的構建方法為利用二型內含子基因敲除技術將SEQ ID NO.8所示的內含子序列插入etfA基因的第639 bp和第640 bp之間。

6.根據權利要求5所述的構建方法，其特征在于，所述的二型內含子基因敲除技術包括如下步驟：

（1）將SEQ ID NO.8所示的內含子序列構建到基因敲除質粒中，得到重組質粒；

（2）將步驟（1）得到的重組質粒轉化丙酮丁醇梭菌，篩選得到etfA基因失活的菌株。

7.根據權利要求6所述的構建方法，其特征在于，步驟（1）中，所述的基因敲除質粒為PMTL007C-E2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

8.權利要求1所述重組丁醇梭菌在制備1,4-丁二醇中的應用。