[發(fā)明專利]一種產(chǎn)1,4-丁二醇的重組丁醇梭菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010040929.2
• 申請(qǐng)日: 2020-01-15
• 公開（公告）號(hào): CN111088209B
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 應(yīng)漢杰;柳東;李楠;王振宇;葛世凱;曹幸園;牛歡青;陳勇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/60;C12N15/74;C12P7/18;C12R1/145
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務(wù)所 32237
• 代理人: 胡建華

本發(fā)明公開了一種產(chǎn)1,4?丁二醇的重組丁醇梭菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，所述的重組丁醇梭菌是通過在丁醇梭菌中表達(dá)4?羥基丁酰輔酶A脫水酶構(gòu)建得到的。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢(shì)：(1)相比于無法生產(chǎn)1,4?丁二醇的野生菌，本發(fā)明構(gòu)造的重組菌在生產(chǎn)1,4?丁二醇的過程中，其產(chǎn)量達(dá)到66mg/L。(2)本發(fā)明進(jìn)一步將丁醇梭菌中etfA基因失活，該重組菌產(chǎn)1,4?丁二醇的產(chǎn)量進(jìn)一步提高了，達(dá)到182mg/L。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)1,4-丁二醇的重組丁醇梭菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

1,4-丁二醇是一種重要的基本有機(jī)化工原料和精細(xì)化工原料，其下游衍生物很多，用途十分廣泛。其衍生物是高附加值的精細(xì)化工產(chǎn)品，廣泛用于溶劑、醫(yī)藥、化妝品、增塑劑、固化劑、農(nóng)藥，主要用于制造四氫呋喃(THF)、聚二苯二甲酸丁二醇脂(PBT)、γ-丁內(nèi)酯(GBL)、N－甲基吡咯烷酮(NMP)、N－乙烯基吡咯烷酮(NVP)等。中國(guó)是全球需求增速最快的地區(qū)，預(yù)計(jì)增速為4％～6％。國(guó)外一些生產(chǎn)商已在規(guī)避BDO產(chǎn)能過剩，德國(guó)巴斯夫公司是全球最大的BDO生產(chǎn)商，年產(chǎn)能為46.7萬噸。然而現(xiàn)在工業(yè)化生產(chǎn)1,4-丁二醇還是以化石燃料為主極大的耗費(fèi)了資源且會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)負(fù)擔(dān)，因而需要開發(fā)一種生物制備的方法來生產(chǎn)1,4-丁二醇。

現(xiàn)有的1,4-丁二醇的方法有兩種，第一種在于利用TCA循環(huán)后的琥珀酸作為底物經(jīng)過一些基因改造生產(chǎn)1,4-丁二醇；另有一種以木糖非磷酸化途徑進(jìn)行生產(chǎn)。第一種方法能量產(chǎn)出為0，還原力為1，第二種方法能量產(chǎn)出為1，還原力為0，其能量產(chǎn)出和還原力均比較低。因此，需要開發(fā)一種高能量產(chǎn)出，高還原力的制備1,4-丁二醇的方法路徑。此外，丁醇梭菌主要用于丙酮-丁醇乙醇(ABE)發(fā)酵，現(xiàn)在也有應(yīng)用于生產(chǎn)2,3-丁二醇，乙偶姻等產(chǎn)品中，且產(chǎn)量較高，應(yīng)用廣泛，而對(duì)相似的1,4-丁二醇上的應(yīng)用極少，利用丁醇梭菌是為了構(gòu)建新的能夠高效產(chǎn)1,4-丁二醇的生物途徑，從而發(fā)展成為一種的梭菌模型。

乙偶姻是合成2,3-丁二醇的前提，丙酮丁醇梭菌自身具有合成乙偶姻的基因，且流向乙偶姻的代謝步驟相對(duì)需要用巴豆酰輔酶A進(jìn)行進(jìn)一步合成的1,4-丁二醇來說較少，代謝支路少更易控制其代謝方向。而生產(chǎn)1,4丁二醇的過程中代謝支路和多余代謝產(chǎn)物也較多，相對(duì)更難控制代謝途徑的轉(zhuǎn)變，也因而更難生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種產(chǎn)1,4-丁二醇的重組丁醇梭菌。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述重組丁醇梭菌的構(gòu)建方法。

本發(fā)明最后還要解決的技術(shù)問題是提供上述重組丁醇梭菌的應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種產(chǎn)1,4-丁二醇的重組丁醇梭菌，所述的重組丁醇梭菌是通過在丁醇梭菌中表達(dá)4-羥基丁酰輔酶A脫水酶構(gòu)建得到的。其代謝圖可見圖1。圖1的代謝過程可看出在丁醇梭菌中表達(dá)4羥基丁酰輔酶A脫水酶并利用巴豆酰輔酶A，是由巴豆酰輔酶A通過4HBD轉(zhuǎn)化生產(chǎn)的1,4-丁二醇。

其中，所述的丁醇梭菌為CGMCC NO.5234或ATCC824。

其中，所述的表達(dá)4-羥基丁酰輔酶A脫水酶是通過4HBD，即cbei_2100(4HBD-1)，ckl_3020(4HBD-2)，abfD(4HBD-3)，lf65-02412(4HBD-4)和ctk-c07640(4HBD-5)中的任意一種的基因片段表達(dá)；其中，cbei_2100，ckl_3020，abfD，lf65-02412和ctk-c07640的核苷酸序列分別為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。

其中，所述的重組丁醇梭菌優(yōu)選導(dǎo)入cbei_2100(4HBD-1)，ckl_3020(4HBD-2)，abfD(4HBD-3)，lf65-02412(4HBD-4)和ctk-c07640(4HBD-5)中的任意一種的基因片段的丙酮丁醇梭菌。