[發(fā)明專利]一種用于檢測(cè)PTK7的比率熒光探針及其制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010040786.5
• 申請(qǐng)日: 2020-01-15
• 公開（公告）號(hào): CN111235229A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬云蘇;王園;劉永杰;楊冬芝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 徐州醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6818
• 分類號(hào): C12Q1/6818;G01N21/64;G01N21/31
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 曹翠珍

本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)PTK7的比率熒光探針及其制備方法，探針采用Fe₃O₄納米粒作為淬滅劑和磁性分離劑，在表面交聯(lián)PTK7適配體(APT)的互補(bǔ)鏈(cDNA)以特異性結(jié)合黃色熒光發(fā)射碳點(diǎn)(y?CDs)標(biāo)記的APT并淬滅其熒光，PTK7與cDNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合APT使其脫離Fe₃O₄納米?；謴?fù)熒光，并通過熒光內(nèi)濾效應(yīng)淬滅藍(lán)色熒光發(fā)射碳點(diǎn)(b?CDs)，形成比率熒光檢測(cè)PTK7。核酸外切酶I增大y?CDs與b?CDs的熒光比值，兩者熒光強(qiáng)度的比值I₅₈₀/I₄₆₀與待測(cè)物濃度log10呈線性關(guān)系，根據(jù)兩者熒光強(qiáng)度的比值，定量測(cè)定PTK7生物分子，靈敏度高、檢測(cè)簡(jiǎn)便，具有免疫反應(yīng)的高選擇性、高親和力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬納米材料、熒光比率技術(shù)和生物分析檢測(cè)領(lǐng)域，具體是基于熒光內(nèi)濾效應(yīng)和酶切循環(huán)放大技術(shù)，將黃色熒光的碳點(diǎn)和藍(lán)色熒光的碳點(diǎn)混合，發(fā)生內(nèi)濾效應(yīng)而使藍(lán)色熒光淬滅，形成比率熒光探針定量生物分子，用于檢測(cè)PTK7的比率熒光探針，靈敏度高于紫外吸收，具有良好的選擇性。

背景技術(shù)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，肺癌已經(jīng)成為中國(guó)癌癥發(fā)病率排行榜第一位，其高發(fā)病率對(duì)早期診斷技術(shù)的革新提出了新的要求。血清中腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)以其創(chuàng)傷小、靈敏度高的特性，在早期診斷中展現(xiàn)出重要作用。熒光檢測(cè)方法作為一種簡(jiǎn)單、靈敏的檢測(cè)方法，在臨床檢驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用，新型熒光納米材料的發(fā)展拓寬了熒光檢測(cè)的應(yīng)用范圍。比率熒光探針通過兩個(gè)熒光信號(hào)的比值表示待測(cè)物的含量，克服單熒光探針易受干擾的缺陷，同時(shí)放大檢測(cè)信號(hào)。酪氨酸蛋白激酶7(PTK7)是一種膜蛋白，與肺癌的發(fā)生發(fā)展具有直接相關(guān)性，其在血清中的含量測(cè)定對(duì)于肺癌診斷具有指征意義，可以作為一種腫瘤標(biāo)志物。但是PTK7在肺癌發(fā)生早期血清含量低，為提高探針的靈敏度，使用酶促循環(huán)放大熒光信號(hào)。

適配體是人工合成的短的單鏈DNA或折疊成獨(dú)特的三維形狀的RNA寡核苷酸。與抗體相比，這些結(jié)構(gòu)能夠以高親和力、高選擇性和特異性靶向分子。相對(duì)于抗體，小尺寸和相當(dāng)簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)使得它們易于合成和化學(xué)修飾。而且，除此之外，它們顯示出較低的免疫原性。因此，適配體已經(jīng)成為臨床醫(yī)學(xué)中檢測(cè)和分離蛋白質(zhì)以及充當(dāng)靶向劑和治療劑的新分子工具。已經(jīng)合成了DNA適配體序列sgc8以特異性識(shí)別PTK7，其中已知其與PTK7結(jié)合具有高親和力。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PTK7在多種其他癌癥類型中過表達(dá)，包括肺癌和結(jié)腸癌，前列腺癌，淋巴結(jié)癌和乳腺癌。

作為一類新型的熒光納米材料，碳點(diǎn)(C-dots)因其優(yōu)異的特性（例如出色的光穩(wěn)定性和低碳性）而引起了極大的關(guān)注。由于其出色的物理和化學(xué)特性、低毒性、優(yōu)異的生物相容性和良好的水溶性，碳點(diǎn)已用于構(gòu)建檢測(cè)蛋白質(zhì)、金屬離子和其它小分子的新型檢測(cè)方法。然而，盡管具有優(yōu)異的光學(xué)性能，但由于缺乏選擇性而限制了熒光測(cè)定的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對(duì)上面所述的問題，提出一種用于檢測(cè)PTK7的比率熒光探針，該比率熒光探針基于熒光內(nèi)濾效應(yīng)和酶切循環(huán)放大技術(shù)，是基于在Fe₃O₄納米粒表面交聯(lián)PTK7適配體(APT)的互補(bǔ)鏈(cDNA)以特異性結(jié)合黃色熒光發(fā)射碳點(diǎn)(y-CDs)標(biāo)記的APT的探針進(jìn)行，具有靈敏度高、選擇性高、檢測(cè)簡(jiǎn)便、測(cè)定范圍廣的特點(diǎn)。

PTK7作為一種腫瘤標(biāo)志物，被廣泛應(yīng)用于腫瘤的早期診斷（肺癌和結(jié)腸癌，前列腺癌，淋巴結(jié)癌和乳腺癌等）。因此，將該探針制備成比率熒光通用檢測(cè)平臺(tái)，可廣泛應(yīng)用于該類生物分子的檢測(cè)。

該探針可用于生物樣本中PTK7含量的測(cè)定，進(jìn)而檢測(cè)多種癌癥，如肺癌和結(jié)腸癌，前列腺癌，淋巴結(jié)癌和乳腺癌等。而且將適配體引入到熒光測(cè)定中，克服碳點(diǎn)選擇性低的缺點(diǎn)。

本發(fā)明的目的還在于提供一種用于檢測(cè)PTK7的比率熒光探針的制備方法。

本發(fā)明的比率熒光探針具體說(shuō)明如下：