[發明專利]一種用于檢測PTK7的比率熒光探針及其制備方法

在審

• 申請號: 202010040786.5
• 申請日: 2020-01-15
• 公開（公告）號: CN111235229A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發明（設計）人: 馬云蘇;王園;劉永杰;楊冬芝
• 申請（專利權）人: 徐州醫科大學
• 主分類號: C12Q1/6818
• 分類號: C12Q1/6818;G01N21/64;G01N21/31
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 曹翠珍

1.一種用于檢測PTK7的比率熒光探針，其特征在于，是采用Fe₃O₄納米粒作為淬滅劑和磁性分離劑，在Fe₃O₄納米粒表面交聯PTK7適配體(APT)的互補鏈(cDNA)以特異性結合黃色熒光發射碳點y-CDs標記的APT并淬滅其熒光；PTK7與cDNA競爭結合APT使其脫離Fe₃O₄納米粒恢復熒光，并通過熒光內濾效應淬滅藍色熒光發射碳點b-CDs，形成比率熒光檢測PTK7。

2.權利要求1所述的一種用于檢測PTK7的比率熒光探針的制備方法，其特征在于步驟如下：

步驟（1）、分別制備黃色熒光發射碳點y-CDs、藍色熒光發射碳點b-CDs和Fe₃O₄納米粒；

步驟（2）、在Fe₃O₄納米粒表面交聯PTK7適配體的互補鏈cDNA形成Fe₃O₄-cDNA復合物；

步驟（3）、制備黃色熒光發射碳點y-CDs標記的APT，獲得y-CDs-APT復合物；

步驟（4）、等體積的 Fe₃O₄-cDNA復合物和 y-CDs-APT在5 ℃搖床反應60 min，得到探針Fe₃O₄-cDNA-APT-y-CDs復合物；

步驟（5）、將DNase I、b-CDs以及不同濃度的PTK7加入步驟（4）的反應體系中；PTK7與cDNA競爭結合Fe₃O₄-cDNA-APT-y-CDs復合物表面的APT使其脫離Fe₃O₄納米粒，熒光由復合后的淬滅狀態改變為恢復熒光；通過熒光內濾效應淬滅藍色熒光發射碳點(b-CDs)，b-CDs被淬滅時熒光值維持不變，而y-CDs的熒光值隨PTK7濃度的增加而提升，y-CDs與b-CDs的熒光比值增大，在一定范圍內，y-CDs與b-CDs的熒光比值隨生物分子濃度增大而增強，而且y-CDs(I₅₈₀)與b-CDs(I₄₆₀)的熒光比值I₅₈₀/I₄₆₀與PTK7的濃度呈線性關系，

步驟（6）、通過測定生物樣品中y-CDs(I₅₈₀)與b-CDs(I₄₆₀)的熒光比值I₅₈₀/I₄₆₀獲得PTK7的濃度。

3.根據權利要求2所述的用于檢測PTK7的比率熒光探針的制備方法，其特征在于步驟（1）中，藍色熒光發射碳點b-CDs的制備是以一水合檸檬酸、二乙烯三胺為原料,二者的摩爾比為1:1，以去離子水為溶劑，在180 ℃反應4 h后獲得。

4.根據權利要求2所述的用于檢測PTK7的比率熒光探針的制備方法，其特征在于步驟（1）中，黃色熒光發射碳點y-CDs的制備是以鄰苯二胺、4-氨基丁酸為原料，二者的摩爾比為1:1，以去離子水為溶劑，180 ℃反應8 h。

5.根據權利要求2所述的用于檢測PTK7的比率熒光探針的制備方法，其特征在于步驟（1）中，Fe₃O₄納米粒的合成如下，首先，乙酸鈉、無水三氯化鐵分別溶解于乙二醇中，在200℃反應8 h；

然后，加入一水合檸檬酸，以水為溶劑，室溫攪拌反應4 h。

6.根據權利要求2所述的用于檢測PTK7的比率熒光探針的制備方法，其特征在于步驟（5）中DNase I的加入濃度為20 U，PTK7的加入體積是600 μL；

反應溫度為37 ℃，反應時間為30 min。

7.根據權利要求2所述的用于檢測PTK7的比率熒光探針的制備方法，其特征在于步驟（5）中：b-CDs的加入量是20 μL。