[發(fā)明專利]大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突變修飾基因及其克隆方法和應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010040262.6
• 申請日: 2020-01-15
• 公開（公告）號: CN111139254A
• 公開（公告）日: 2020-05-12
• 發(fā)明（設計）人: 李海燕;劉偉燦;李曉薇;王法微;周永剛;王南;董園園
• 申請（專利權）人: 吉林農業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/10;C12N15/10;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/54
• 代理公司: 長春眾邦菁華知識產(chǎn)權代理有限公司 22214
• 代理人: 于曉慶

大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突變修飾基因及其克隆方法和應用，屬于分子生物學和生物領域。本發(fā)明中，大豆GmEPSPS1基因在植物EPSPS酶保守區(qū)發(fā)生定向單氨基酸和雙氨基酸置換后的基因序列分別為SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；大豆GmEPSPS2基因在植物EPSPS酶保守區(qū)發(fā)生定向單氨基酸和雙氨基酸置換后的基因序列分別為SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。上述獲得的基因均衍生于大豆內源GmEPSPS1和GmEPSPS2基因，具有更強的草甘膦抗性能力，在生物安全性及利用基因工程技術手段創(chuàng)制抗草甘膦大豆新品系應用上具有廣泛的社會和經(jīng)濟效益。

技術領域

本發(fā)明屬于分子生物學和生物技術領域，具體涉及一種大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突變修飾基因及其克隆方法和應用。

背景技術

大豆是我國重要的糧食和油料作物，在我國糧食產(chǎn)業(yè)中占據(jù)著非常重要的地位。目前，我國大豆生產(chǎn)的增長速度遠不能滿足我國人民的生活需求，需要依靠進口國際市場的轉基因大豆。

田間雜草生長過盛是導致大豆作物減產(chǎn)的主要原因之一。除草劑草甘膦憑借其低毒、高效、廣譜的除草優(yōu)勢占據(jù)著除草劑市場的主導地位。其作用機制主要是抑制莽草酸途徑中的EPSPS酶，草甘膦與PEP競爭性結合EPSPS酶活性位點，使芳香族氨基酸合成受阻，進而使植物生長所需的生長激素、木質素等營養(yǎng)物質的合成也會受阻，進而導致植物死亡。EPSPS酶一般被分為兩種類型，類型I主要來源于植物，大腸桿菌等部分微生物，對除草劑草甘膦的耐受性較低。類型II來源于覆盆子土壤桿菌、無色桿菌、假單胞菌等一些可以耐受極端環(huán)境影響的菌株，一般對草甘膦具有較高的耐受性。目前，國際上推廣的抗草甘膦轉基因大豆主要是利用基因工程手段過表達微生物來源的II型EPSPS基因的轉基因大豆，其食品安全性備受爭議。挖掘大豆內源的抗草甘膦基因，對利用基因工程手段培育安全性較高的抗除草劑大豆新種質，具有重要意義。

根據(jù)氨基酸序列同源比對分析結果表明，不同植物物種中，EPSPS酶具有保守的氨基酸序列區(qū)域“LGNAGTAMRPLTAA”，據(jù)報道，這個保守的區(qū)域可能是草甘膦與PEP競爭性結合EPSPS酶的活性位點。然而，大豆中EPSPS酶保守區(qū)“LGNAGTAMRPLTAA”發(fā)生突變修飾后對草甘膦抗性能力的影響并沒有被公開報道過。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突變修飾基因及其克隆方法和應用。

本發(fā)明為解決技術問題所采用的技術方案如下：

本發(fā)明的大豆GmEPSPS1和GmEPSPS2定向突變修飾基因，它是大豆GmEPSPS1基因和GmEPSPS2基因在植物EPSPS酶保守區(qū)發(fā)生定向單氨基酸置換和雙氨基酸置換后獲得的基因；所述大豆GmEPSPS1基因在植物EPSPS酶保守區(qū)發(fā)生定向單氨基酸置換后的基因為mGmEPSPS1(PS)基因，其序列如SEQ ID NO.2所示，所述大豆GmEPSPS1基因在植物EPSPS酶保守區(qū)發(fā)生定向雙氨基酸置換后的基因為mGmEPSPS1(TIPS)基因，其序列如SEQ ID NO.3所示；所述大豆GmEPSPS2基因在植物EPSPS酶保守區(qū)發(fā)生定向單氨基酸置換后的基因為mGmEPSPS2(PS)基因，其序列如SEQ ID NO.5所示，所述大豆GmEPSPS2基因在植物EPSPS酶保守區(qū)發(fā)生定向雙氨基酸置換后的基因為mGmEPSPS2(TIPS)基因，其序列如SEQ ID NO.6所示。

作為優(yōu)選的實施方式，所述大豆GmEPSPS1基因和大豆GmEPSPS2基因為大豆吉育72中兩個編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因。

作為優(yōu)選的實施方式，所述大豆GmEPSPS1基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述大豆GmEPSPS2基因序列如SEQ ID NO.4所示。